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相思子毒素(abrin toxin，AT)和蓖麻毒素(ricin toxin, RT)都属于植物来源的致死性毒素，有类似的分子结构和作用机制，有A、B两条多肽链，分子量约为60～65 kDa。其中，毒素A链(RTA和ATA)是毒性链，B链（RTB和ATB）是结合链。作为重要的生物恐怖剂，RT和AT被美国疾病控制中心(CDC)定义为B级生物威胁剂，发展有效的防治手段已成为各国生防领域的重要研究任务，而主动免疫是一种预防毒素中毒的有效方法。针对两种毒素的疫苗研究，目前主要集中于类毒素和基于A链蛋白，而毒素B链的免疫原性则存在争议，但其他毒素的B链蛋白却被证明是一种良好的疫苗候选抗原。 本研究的目的就是构建AT的重组B链蛋白(rATB)、RT的重组B链蛋白(rRTB)以及两毒素B链的嵌合体蛋白(RTB-ATB)，采用原核表达系统表达、纯化rATB、rRTB和RTB-ATB嵌合体蛋白并进行抗原性分析，然后分别以三种蛋白为免疫原免疫动物，评价其对抗天然RT和AT中毒的免疫保护效果、免疫机制和组织病理学变化，初步确定冻干保存条件，筛选安全有效的RT和AT候选抗原，为制备两毒素的B链疫苗奠定基础。 根据GenBank检索得到的序列(ATB氨基酸登录号:1908235A，RTB核酸登录号:X52908)，运用密码子优化软件对ATB、RTB基因进行优化，合成目的基因后连接载体pQE-80L、pTIG-Trx、pLPP-OmpA，分别获得三种重组表达质粒并进行表达条件的优化。同时，嵌合体基因RTB-ATB采用柔性linker连接RTB和ATB，获得pQE-80L/RTB/ATB、pTIG-Trx/RTB/ATB、pColdⅠ DNA/pKJE7/RTB/ATB，并进行表达条件的优化。选取M15/pQE80L-ATB、M15/pQE80L-RTB、M15/pQE80L-RTB/ATB经1.0 mM IPTG30℃诱导表达5h，三种重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后梯度复性至PBS，Western blot验证重组蛋白的抗原性，MTS法验证重组蛋白的毒性。分别将三种蛋白作为免疫原，采用析因设计方式分别免疫Balb/C小鼠，主因素包括:重组蛋白的剂量、免疫方式、免疫周期、攻毒剂量。每次免疫后1周均采用间接ELISA方法检测小鼠血清中IgG和抗体亚型，然后进行毒素(AT、RT)攻毒实验。体外中和实验依据上述所选的免疫方案进行，分析免疫保护效果，并应用流式细胞技术进行脾细胞中Th1类细胞因子(IFN-γ)、Th2类细胞因子(IL-4)的检测。同时，对三种蛋白免疫攻毒后存活的小鼠进行组织病理学分析。然后将三种重组蛋白分别与三种不同类型的佐剂(Alum、Freunds、SPO1)混合免疫小鼠，采用小鼠攻毒试验和体外中和实验进一步评价蛋白的免疫效果。最后，初步确定三种蛋白的冻干保护剂配方，并根据选择的冻干保护配方冻干蛋白，复融后免疫小鼠进行免疫保护评价。 结果表明合成的目的基因ATB、RTB和RTB-ATB与预期结果完全一致。ATB全长804 bp，编码268个氨基酸残基;RTB全长786bp，编码262个氨基酸残基。重组质粒pQE80L-ATB、pTIG-Trx/ATB、pLPP-OmpA/ATB、pQE80L-RTB、pTIG-Trx/RTB、pLPP-OmpA/RTB经PCR和酶切鉴定证明构建成功，在大肠杆菌表达系统中均以包涵体形式存在，且相对分子质量均约为30 kDa。两种目的蛋白采用Ni-NTA亲和层析柱纯化，蛋白纯度均达97％以上，rATB可与相应的抗天然AT兔多克隆抗体发生特异反应，rRTB能被相应的抗天然RT兔多克隆抗体特异性识别。嵌合体基因RTB-ATB开放阅读框架全长1635 bp，编码545个氨基酸残基。经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pQE80L-RTB/ATB、pTIG-Trx-RTB/ATB和pCold I DNA/RTB/ATB，嵌合体蛋白以包涵体形式存在且经SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60 kDa，纯度可达98.9％。经免疫印迹实验验证，嵌合体蛋白能同时和两种毒素的多克隆抗体特异性反应。以上三种重组蛋白经细胞毒性实验证明均无毒性。 间接ELISA结果表明rATB、rRTB蛋白免疫Balb/C小鼠后血清中能检测到相应的抗AT或抗RT特异性抗体，IgG的效价均可达到1∶106以上，嵌合体蛋白RTB-ATB免疫后血清中可同时检测到抗RT、抗AT特异性抗体，而PBS对照组则没有抗体产生(p＜0.05); IgG1的效价能达到1∶105以上，免疫组与对照组的差异有统计学意义;IgG2。则无明显变化。用天然AT或RT对免疫小鼠进行攻毒试验，rATB（腹腔注射）和rRTB（皮下多点注射）均在25μg/只的蛋白免疫剂量下，抵抗最高剂量为5×LD50的天然RT或AT毒素中毒，保护率均为100％。嵌合体蛋白RTB-ATB则在25μg/只、腹腔注射、免疫周期为0-14-28-42天的免疫方式下，抵抗最高剂量为4×LD50的天然RT或AT攻击，保护率为100％，且免疫方式、免疫周期所产生的免疫效果没有明显差异(p＞0.05)。组织病理学分析结果显示三种蛋白免疫组小鼠的主要脏器损伤均明显好于PBS组。 细胞因子检测结果显示三种重组蛋白免疫小鼠后，IFN-γ的表达量与PBS比较无统计学意义，而IL-4的表达量显著提高(p＜0.05)，提示rATB、rRTB和RTB-ATB均能介导Th2型应答为主的免疫反应。三种蛋白分别与Alum、Freunds、SPO1混合后免疫小鼠，血清中IgG的效价均可达到1∶105以上，与单独蛋白免疫组无差异(p＞0.05)，而佐剂对照组则没有抗体产生;用天然AT或RT对免疫小鼠进行攻毒试验，rATB和rRTB均能抵抗5×LD50的天然毒素;RTB-ATB能中和4×LD50的RT或AT。以上结果说明添加不同佐剂对三种蛋白的免疫效果无明显提高。三种重组蛋白的冻干保护剂配方分别为:rATB与10 mg/mL的蔗糖混合保存;rRTB在PBS溶液中保存;RTB-ATB与25 mg/mL蔗糖混合保存为好。小鼠攻毒保护实验和体外中和实验均表明三种蛋白冻干复融后的免疫保护效果无明显变化。