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糖尿病肾病(Diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病(Dabetes mellitus,DM)严重慢性微血管并发症,最终发展为终末期肾病,成为导致透析的主要原因。DM时,由于肾脏内血流动力学改变、糖脂代谢紊乱和氧化应激反应胰岛素抵抗及微炎症状态,导致细胞因子分泌失衡或通过细胞信号转导通路,影响肾脏固有细胞的生长、增殖、凋亡；进而导致肾小球系膜细胞增生,内皮细胞损伤,足细胞损伤、凋亡和脱落,从而改变肾单位结构,影响肾小球滤过功能,出现蛋白尿。DM一旦进入DKD,会造成肾脏进行性损害,早期病理改变为肾脏体积增大及肾小球系膜基质增多,晚期发生肾小球硬化及肾脏纤维化,临床治疗难度较大。因此,研究防治DKD有效方法,已成为现代医学研究的热点和难点。最新研究发现,足细胞在DKD进展过程中发挥重要作用。糖、脂毒性血管紧张素Ⅱ,氧化应激及炎症因子等均可通过细胞信号转导通路引起足细胞骨架蛋白破坏、裂孔膜受损、导致足细胞凋亡、数量减少甚至脱落,促进DKD病程进展。其中PI3K/AKT信号转导通路是真核细胞内存在的经典抗凋亡通路,足细胞裂孔膜蛋白(Slit diaphragm, SD) CD2AP-nephrin-Podocin复合体可与P13K-P85亚基结合激活PI3K/AKT信号转导通路,AKT磷酸化为P-AKT,同时磷酸化下游靶蛋白Bad,发挥抑制足细胞凋亡作用。导师赵宗江教授深入探求DKD发病特点,结合《内经》“脏痿”理论,提出了DKD“肾痿”假说,并在此基础上组方糖肾平胶囊(以下简称糖肾平)治疗DKD,临床效果显著。本研究通过腹腔注射S TZ复制DKD大鼠模型,在高糖环境下用LPS刺激足细胞建立DK D细胞模型,采用免疫组织化学、原位杂交化学、Western blottin g和RT-PCR方法,探讨糖肾平对DKD大鼠肾脏的保护作用及其对P13K/AKT信号转导通路的干预机制。进一步为“肾痿”假说提供实验依据。目的：动物实验：复制DKD大鼠模型,以厄贝沙坦为阳性对照药物,观察糖肾平对DKD大鼠药效学影响；观察糖肾平对DKD大鼠足细胞标志蛋白nephrin、CD2AP和Podocalyxin蛋白及mnRNA表达的影响；并初步观察糖肾平对DKD大鼠肾组织P13K/AKT信号转导通路的影响。细胞实验：利用高糖+LPS刺激足细胞来建立DKD细胞模型,观察糖肾平含药血清对大鼠足细胞PI3K/AKT信号转导通路的影响。探讨糖肾平保护DKD大鼠足细胞的作用机制。方法：1.糖肾平对S TZ诱导的DKD大鼠药效学的影响：74只Wistar大鼠随机分组为：正常组10只,造模组64只。采用空腹状态下,一次性腹腔注射STZ(45mg/kg)进行造模；将模型成功的大鼠再按照体质量随机分为模型组、厄贝沙坦组、糖肾平小剂量组和糖肾平大剂量组。观察大鼠一般状态、体重,检测24h尿蛋白定量。14周末,股动脉取血,检测血清中尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(Serum creatinine, Scr)、甘油三脂(Triglyeride, TG)含量。称取大鼠肾重计算肾质量体质量比。肾组织石蜡切片进行HE.Mallory、 PASM-HE. Masson染色,观察肾组织病理变化。2.透射电子显微镜：观察DKD大鼠肾小球基底膜及足突等超微结构3.ELISA方法检测血清中一氧化氮(Nitric oxide, NO)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)水平。4.免疫组织化学：检测大鼠肾组织中nephrin、CD2AP、Podocalyxin、P13K、AKT、Bad蛋白表达水平。5.原位杂交化学：检测大鼠肾组织中CD2APmRNA表达水平。6.TUNEL染色：检测大鼠肾小球中细胞凋亡情况。7.RT-PCR：检测肾组织nephrin、CD2AP、PI3K、AKT、BadmRNA表达水平。8.细胞实验：足细胞复苏后33℃培养,37℃分化,分化成熟后采用高糖+LPS刺激足细胞,用糖肾平大、中、小剂量含药血清进行培养干预48h。采用Western blotting检测,足细胞中CD2AP、PI3K、AKT, p-AKT、Bad蛋白表达水平；采用RT-PCR检测,足细胞中nephrin、CD2AP、PI3K、AKT. BadmRNA表达水平。9.实验数据用SPSS17.0进行统计学处理。结果：1糖肾平对STZ诱导的DKD大鼠药效学的影响：与模型组比较,经过糖肾平治疗后,各组大鼠体重、皮毛光泽度、饮食、活动状态均有不同程度改善,糖肾平大、小剂量治疗组体重均有不同程度增长(P<0.01),大鼠肾重／体重比显著减小(P<0.01)；与模型组比较,糖肾平各组治疗后,从第四周起DKD大鼠24h尿蛋白定量显著减小(P<0.01)；与模型组比较,治疗后血清BUN、Scr和TG降低(P<0.01)；与模型组比较,糖肾平各治疗各组肾小球硬化指数评分显著降低(P<0.01)。2透射电子显微镜：正.常组大鼠肾小球基底膜正常、足突正常。模型组大鼠基底膜阶段增厚、足突融合。糖肾平小剂量组：基底膜轻度增厚、足突轻度融合。厄贝沙坦组、糖肾平大剂量组：基底膜基本正常。3糖肾平对DKD大鼠氧化应激的影响：与模型组相比,糖肾平大、小剂量组MDA水平显著降低(P<0.01),SOD、NO水平显著升高(P<0.01)。4大鼠肾组织nephrin、CD2AP、Podocalyxin、PI3K、AKT、Bad蛋白与mRNA水平的表达：与模型组相比,糖肾平治疗组nephrin、CD2AP. Podocalyxin、PI3K、AKT蛋白和mRNA水平明显增高(P<0.05),Bad蛋白和mRNA表达显著减小(P<0.05)。5足细胞nephrin、CD2AP、PI3K、AKT、Bad蛋白与mRNA水平的表达：与高糖+LPS组相比,足细胞nephrin、CD2AP、PI3K蛋白和mRNA水平明显增高P<0.01),Bad蛋白和nRNA表达显著减小(P<0.01)。与高糖+LPS组相比较,糖肾平含药血清大剂量组足细胞P-AKT/AKT值明显增高(P<0.05)。结论：1糖肾平能够增加DKD大鼠体重,降低肾质量体质量比值,改善大鼠肾功能,降低24h尿蛋白定量,减轻DKD大鼠肾脏病理改变,对肾脏有一定的保护作用。2糖肾平能够改善DKD大鼠体内氧化应激状态,对肾脏有一定的保护作用。3糖肾平能够增加DKD大鼠肾组织nephrin、CD2AP、Podocalyxin蛋白和mRNA的表达,增加PI3K、AKT蛋白和mRN A表达,降低肾组织Bad蛋白和mRNA的表达,通过调控PI3K/AKT信号转导通路保护DKD大鼠肾功能。4糖肾平含药血清能够降低高糖环境下LPS刺激的足细胞中Bad蛋白和nRNA的表达,增加CD2AP、PI3K蛋白和mRNA表达,增加nephrinmRNA的表达,增加P-AKT/AKT值。糖肾平可通过维持足细胞SD蛋白稳定表达来激活PI3K/AKT信号转导通路,起到抑制足细胞凋亡的作用。本实验进一步验证了DKD“肾痿”假说的正确性,并为其提供了新的实验证据。