论文部分内容阅读
在生命体中血红素蛋白与小分子配体之间的配位反应广泛存在,通过研究它们在蛋白分子反应活性区域内的相互作用能够帮助人们更好的了解血红素蛋白的结构与功能。在线粒体中细胞色素c(Cytochrome c,Cyt c)扮演着重要角色,它与多功能生物信使分子一氧化氮(Nitric oxide,NO)的快速反应影响线粒体功能的调节及细胞凋亡机制。Cyt c与NO之间的相互作用情况复杂,反应过程及产物容易受环境因素的影响。本文采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱等方法系统地研究了Cyt c与NO之间的相互作用受外界因素的影响及其中间复合物解离的反应。其结果对利用NO检测细胞内蛋白变化,进而对细胞凋亡检测研究具有重要的意义。主要开展的工作内容如下:1.采用光谱法研究不同价态Cyt c、不同影响因素下,Cyt c直接与溶液中ProliNONOate释放的NO之间的结合反应,并且阐述了反应中的荧光猝灭机制。结果表明:与二价铁Cyt c(Cyt c-Fe(II))相比,NO更容易与三价铁Cyt c(Cyt c-Fe(III))反应,溶液中可能生成的NO衍生物对两者结合生成Cyt c-NO复合物没有影响。确定了Cyt c与NO的结合属于静态猝灭机制,有一个结合位点且结合力较弱。在一定范围内随着ProliNONOate浓度增加,生成的物质逐渐增多,最终完全反应;而继续增加ProliNONOate浓度时并不会促进两者的反应,反而起到一定的抑制作用。离子表面活性剂的添加会引起蛋白结构改变,其中在阴离子表面活性剂AOT存在的条件下两者更容易结合。Cyt c与NO的结合会改变蛋白构象及周围氨基酸残基的微环境。ProliNONOate的浓度低于9.128×10~-44 mol/L时,208 nm和222 nm吸收峰变化较小,其浓度与Cyt c溶液浓度摩尔比超过100:1时蛋白的二级结构会受到破坏。2.运用紫外-可见光谱技术研究还原性物质及光照游离氨基酸对Cyt c与NO反应的影响机制。结果显示:蛋白溶液中含有谷胱甘肽或维生素c时都不利于Cyt c与NO结合。溶液中含硫游离氨基酸的存在对两者结合的影响程度不同,其中半胱氨酸(Cys)残基中含有-SH基团对结合反应起到抑制作用。激光照射使Cyt c中血红素Fe-S键变弱促进Cyt c与NO的结合,然而当溶液中色氨酸(Trp)残基存在时进行激光照射对两者结合的阻碍作用最强。圆二色光谱表明短时间的光照不会引起Cyt c二级结构的破坏。3.Cyt c-Fe(Ⅲ)-NO是氧化态Cyt c与NO结合后生成的中间复合物,该复合物不稳定且易发生解离。不同的环境因素可能影响Cyt c-Fe(Ⅲ)-NO复合物的解离过程,导致解离结果不同。其结果对进一步研究Cyt c蛋白酶活性及控制NO释放的生物学作用具有重要的意义。紫外-可见吸收光谱和时间过程光谱的检测结果表明:未经处理的Cyt c溶液中生成的复合物解离速率是经过氧化剂氧化后Cyt c-Fe(Ⅲ)-NO解离速率的两倍。当溶液中离子强度较强、pH呈碱性、温度增加以及表面活性剂AOT存在时,复合物稳定性降低促进解离的发生。而除氧条件和谷胱甘肽存在时使Cyt c-NO复合物的解离速率减小。运用同步荧光光谱及圆二色光谱研究蛋白构象变化,得到复合物解离前后Cyt c内部的疏水结构及其二级结构没有发生改变。