旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞相关蛋白抗体抗肿瘤效应研究

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本实验通过ELISA和Western blotting的方法确定旋毛虫与MCF-7乳腺癌细胞之间具有相关抗原蛋白,通过免疫筛选的方法在旋毛虫cDNA表达文库里筛选出与MCF-7细胞相关的旋毛虫基因蛋白TS498,并通过动物试验对其抗肿瘤效应进行观察。相关抗原的制备首先制备抗旋毛虫肌幼虫可溶性蛋白高免血清和MCF-7乳腺癌细胞抗原抗血清,分别免疫小鼠,获得旋毛虫抗血清和MCF-7细胞抗血清。然后通过ELISA法检测旋毛虫抗原与MCF-7抗血清间,MCF-7抗原与旋毛虫抗血清间的交叉反应。ELISA结果显示,旋毛虫与MCF-7细胞间具有交叉反应,初步说明两者存在相关抗原。然后通过Western-bloting法检测了旋毛虫抗血清与MCF-7乳腺癌细胞抗原间的免疫反应。获得5条特异性反应条带。与蛋白标准分子量Marker对比,与旋毛虫相关的MCF-7细胞抗原大小约为18kDa,29kDa,32kDa,56kDa,60kDa。采用多肽蛋白分离柱(超滤管)分离与旋毛虫相关的MCF-7细胞抗原相应分子量范围内的蛋白。并利用分离的相关抗原相应的相关抗原多抗。旋毛虫与MCF-7乳腺癌相关抗原蛋白基因的筛选利用相关抗原的抗血清作为筛选抗体,对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选,获得阳性噬菌斑,复筛得到一致的阳性斑后,对噬菌体插入片段进行扩增,并对所获得的蛋白基因进行序列测定和生物信息学分析。从获得的12条序列中选定一条进行下一步试验,此条序列的开放阅读框大小为498bp,经比对属于旋毛虫热休克蛋白家族的小分子量热休克蛋白。对其进行克隆,并原核表达,获得TS498的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫小鼠获得相应的抗血清。体外细胞免疫荧光试验结果表明,TS498蛋白抗血清能与MCF-7细胞结合。相关抗原蛋白TS498抗血清对荷有MCF-7实体瘤的抗肿瘤效应观察用MCF-7细胞接种裸鼠,建立乳腺癌裸鼠实体瘤模型。裸鼠荷瘤20d后,对荷瘤小鼠进行血清治疗一个月,在此过程中观察试验动物的精神状况、有无肿瘤生长,肿瘤的大小变化、有无死亡等项目。治疗一个月后处死小鼠,测量肿瘤重量、体积,并计算抑瘤率。结果表明,相关抗原TS498蛋白抗血清具有抗肿瘤效应,最高抑瘤率达36.12%。此实验结果为从不同方面研究旋毛虫抗肿瘤效应奠定基础。同时也为抗肿瘤生物制剂的研发提供了可靠的科学依据。
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