水果病原真菌毒性的多重检测及层出镰刀菌DON毒素和侵染的调控研究

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水果是我国食品经济不可或缺的一大部分,但在运输消费过程中,易发生采后病害;尤其是在温暖湿热的热带和亚热带地区。采后水果易感染各种各样病原菌,同时伴随着真菌毒素污染,对人类健康造成了威胁。在本论文中,围绕着四个方面开展研究。  首先,根据生物毒性效应改进了毒性检测方法,提高了精确度,并确定了底物敏感度(硫酸锌溶液的IC50为7.64±0.42mg/mL)。在此基础上,发现了青海弧菌发光抑制和真菌毒素浓度间存在良好线性相关关系(R2>0.98)和发光抑制与真菌菌液浓度间的线性相关关系(R2>0.96)。据此,计算得到各个样品的IC50值,推断了不同菌株的产毒潜力,其中以镰刀菌属的菌株毒性较强,并以层出镰刀菌毒性最大(IC50=17.49%±2.15%)。并采用高效液相色谱与串联质谱联用(HPLC-MS/MS)技术进一步对样品内真菌毒素进行定量测定,与青海弧菌所测得的IC50值大小趋势一致。验证了青海弧菌Q67直接用以评估真菌次生代谢物潜在毒性的可靠性。另外,根据PCR分析结果发现绝大部分菌株中都存在毒素合成相关基因,然而用HPLC-MS/MS方法进行定量检测发现仅四株镰刀属菌株和两株青霉属菌株能够检出毒素,推测原因为不同体外培养环境所诱使结果,或者由于真菌菌株的进化仅留存在部分同源基因。  其次,利用杨桃中分离的层出镰刀菌对香蕉、木瓜、火龙果进行了侵染实验,验证了该菌种的寄主非专一性,并发现由于宿主的差异,真菌呈现不同致病表征。利用扫描电镜观察进一步探究了碳源对真菌致病性的影响,发现果糖培养后真菌对果实侵染更严重,香蕉薄壁细胞壁降解明显。并且果糖组的菌丝生长旺盛,表现为菌丝密集分支众多,在青香蕉中生长的菌丝直径达1.810±0.078μm和2.555±0.108μm,而蔗糖组菌丝直径仅为1.441±0.096μm和2.092±0.0035μm。故而推测果糖的预培养改变了真菌的寄生策略,提高了真菌所能掠夺的寄主营养量,从而促进了菌丝的生长和侵染。  第三,本实验选取了多个条件因子进行实验。结果显示,果糖环境、酸性和碱性环境,以及有机酸类、抗氧化物类和多糖类处理都会影响脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素的合成。其中果糖环境(OD值=0.377±0.060)相比于蔗糖环境(OD值=1.001±0.010)抑制了真菌的生长,但是果糖培养下DON含量为17.24±0.18ng/mL,蔗糖培养仅为7.29±0.44ng/mL,说明果糖促进了DON毒素的合成。另外低pH和高pH值环境抑制真菌生长的同时促进了DON毒素的合成(提高率>300%)。而植物代谢的抗氧化物类对真菌DON毒素的检出量抑制了约50%。在有机酸处理对真菌的生长和产毒都起到抑制作用,以草酸抑制生长程度最高(抑制率>80%),酒石酸抑制DON毒素最强(抑制率>70%)。此外,多聚糖类化合物均促进菌生长并抑制真菌毒素(抑制率>50%)。  最后,本实验通过对转录组信息的分析,在分子层面上探究了不同碳源(果糖相比于蔗糖)对层出镰刀菌产DON毒素和侵染力的调控机制,发现了1410个上调基因和1438个下调基因,涉及到碳代谢的基因占很大比重(以淀粉和蔗糖代谢途径为最),并且其他初级和次级途径均与碳水化合物代谢途径间存在互作。结合qRT-PCR技术,分析发现次级代谢过程中参与毒素合成的Tri基因中Tri101,Tri1,Tri3,Tri7,Tri8和Tri11被显著上调,以及编码细胞壁降解酶的基因也被显著上调。此外,还发现Tri基因的转录抑制子pacC和creA的下调表达。因而本章通过对转录组的分析,阐明了果糖通过诸多通路促进DON毒素产量和真菌的侵染力的机制,并推测MAPK信号通路可能是抑制体外生长的原因。另外,还发现原花青素对层出镰刀菌的影响主要是氧化还原过程(1485个基因下调,194个基因上调)和氧化还原酶活性(654个基因下调,90个基因上调),并且Tri4和Tri11基因均下调。综合以上两组转录组分析结果,阐述了果糖和OPC分别促进或抑制层出镰刀菌产DON毒素的机制,即由于线粒体内膜上质子汞的差异导致了线粒体内的活性氧压力上升或下降,激发或抑制了DON毒素的合成。
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