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心脏骤停（cardiac arrest CA）是心脏急症中最严重的情况，也是发达国家首要的死亡原因。随着心肺复苏（Cardiopulmonary resuscitation,CPR）技术的普及和急救体系的完善，人们意识到仅仅灌注心跳骤停患者自主循环的恢复是不够的，心跳骤停后的综合治疗应该是“心血管急救成人生存链”中重要环节之一。尽管越来越多的心脏骤停患者都得到早期救治，但是脑功能完全恢复的患者极低，给家庭及社会带来了巨大的精神和经济负担。怎样来进一步提高复苏成功率，尤其是脑复苏的成功率依然是急诊危重病医学领域研究的重点和难点。因此，探寻新的有效地治疗方法是非常有必要的。 治疗性低温（Therapeutic hypothermia）是目前被大量临床研究证明有效并得到多个专业协会强力推荐的脑保护措施之一。已经证实，治疗性低温对CA所致脑损伤有很多种保护机制，其机制主要是通过阻断CA后缺血缺氧导致脑损伤的病理生理发展过程来实现。主要的机制包括：①降低脑代谢率；②减轻钙超载；③抑制兴奋性氨基酸释放；④抑制自由基产生；⑤抑制炎症因子的产生；⑥抑制凋亡。目前认为，细胞死亡分为三种类型：坏死、凋亡和自噬。凋亡，即Ⅰ型程序性细胞死亡，具有依赖半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific proteases,caspase)参与，细胞皱缩、染色体浓聚、凋亡小体形成和DNA降解等特征，其细胞的剩余部分最终被巨噬细胞清除掉。自噬，即Ⅱ型程序性细胞死亡，以自噬体的出现为特征，不依赖于半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific proteases,caspase)的参与，自噬体以及其内的细胞成分最终通过自身的溶酶体系统所清除掉。对于凋亡与CA后复苏脑保护的研究已有不少报道，而对于自噬途径与CA后脑保护的研究机制不甚清楚。 自噬是一种广泛存在于真核细胞中并且通过溶酶体机制来降解自身成分的代谢途径。自噬不仅可以通过激活经典的自噬小体-溶酶体途径，而且还可以通过影响坏死和凋亡的发生、发展对细胞死亡来进行调控。由于自噬是一种早于凋亡发生的程序，它具有抗凋亡和促凋亡的两面性，如何对其进行正确的调控而使组织免于发生不可逆的凋亡坏死具有重要意义，通常情况下，在多数细胞内，自噬处于一个基线水平。自噬在某些情况下可被激活，保护细胞免于坏死和凋亡的危险。如在缺血/再灌注、TNF-α、氧化、钙超载、毒性化合物等因素的刺激下，自噬被激活，将受损的线粒体清除，细胞对低氧的耐受力被提高，同时，避免凋亡因子释放进入胞浆，对细胞起到一定的保护作用。但当自噬损伤严重或能力不足时，线粒体凋亡因子将激活凋亡程序。当细胞核开始断裂时，自噬体数量增多，提示自噬与凋亡协同作用导致细胞死亡。因此，细胞的自噬对人类健康好似一把“双刃剑”，这取决于细胞周围环境的变化、疾病进展的不同阶段和治疗干预措施的不同。本研究采用家兔右心室致颤心肺脑复苏模型，在复苏同时颈部降温达到快速降低脑部温度起到脑保护作用。并应用Western blot、干湿重法、TUNNEL以及电镜等方法，探讨自噬与凋亡在低温性保护机制中的相互作用机制。进一步阐明低温性治疗在脑保护作用新的分子机制，以及为低温性的临床治疗应用提供新的实验和理论依据。 第一部分 经右心室电刺激致颤建立家兔心脏骤停模型的建立 目的： 建立一种稳定、有效的家兔电致颤心跳骤停（CA）脑复苏模型。 方法： 选用20只新西兰雄性家兔，采用体表胸壁及心内膜下交流电诱发室颤的方法制作CA模型，CA4min后开始心肺复苏（CPR）。记录手术自主循环恢复时间（TROSC）、恢复率、操作复苏前时间（TOP）以及肾上腺素次数、除颤次数、72h大脑皮质凋亡细胞检测、24小时、72小时生存率以及进行神经功能缺陷评分(Neural defict Score，NDS)。另10只家兔为对照组，只行致颤前手术操作，不致颤。 结果： 1.20只家兔全部诱发心脏骤停成功，室颤发生率为100%。除颤和肾上腺素次数为1.2±0.89、1.6±0.75；TOP和TROSC分别是79±25分、268±33秒；自主循环恢复率为80%；24小时、72小时存活率为50%、30%。2.血浆神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平显著升高，复苏后72小时略有回降，但仍高于造模前（P＜0.05）。3.复苏后72小时大脑皮质区与对照组相比，出现了较多神经细胞的凋亡（P＜0.05）。4.神经功能缺陷评分在复苏后3小时时最低，以后渐趋好转。 结论： 该模型操作相对复杂、结果稳定、复苏成功率高，是一个较为理想的心肺脑复苏研究模型。 第二部分 治疗性低温通过激活3型PI3K通路增加自噬减轻兔心肺复苏后脑损伤机制研究 目的： 探讨自噬在低温治疗心肺脑复苏保护机制中的作用 方法： 66只健康雄性兔子随机分为3组，空白对照组，复苏组和低温治疗组。除空白对照组每组再分为三个亚组，即自主循环恢复（ROSC）后4、9、24h组，除空白对照组为6只家兔外，另两组组各时间点均为10只。模型采用经右心室致颤4分钟后复苏模型，低温治疗组在ROSC后立即启动颈部快速降温，目标脑温为32-34℃，以后维持ROSC4h；右侧大脑应用Western-blotting的方法测定脑组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3和相关通路蛋白VPS34、ATG14；取左侧大脑，干湿重法来测脑组织含水量。并对复苏组和低温治疗组ROSC24h进行NDS评分。 结果： 1.复苏组ROSC后9,24h LC3-Ⅱ、Beclin-1VPS34和ATG14表达较空白对照组明显增加（P＜0.05），且复苏对照组24h较9h明显增加（P＜0.05）；2.低温治疗组ROSC后9,24h LC3-Ⅱ、Beclin-1、VPS34和ATG14较复苏对照组相应时间点增加，且ROSC24h较9h明显增加（P＜0.05）；3.复苏组脑组织含水量ROSC9h、24h较空白对照组明显增加（P＜0.05），低温治疗组脑组织含水量ROSC后9,24h较复苏组明显减少（P＜0.05）。4.复苏组和低温组ROSC24h的NDS评分均较差，无明显统计学差异（P＞0.05）。 结论： 1.复苏后脑组织水肿是明显增加的，并随时间点延长有增加趋势；颈部降温治疗能减轻家兔复苏后神经细胞的水肿，起到脑保护作用；2.复苏后各时间点自噬Beclin-1、LC3的表达增加并随复苏时间点增加趋势明显，而且自噬的表达增加考虑通过3型PI3K的Beclin-1/VPS34/ATG14调节有关；3.复苏后予低温治疗后自噬表达较复苏后相应时间点明显增加，说明自噬的激活是低温治疗心肺复苏后脑保护的作用机制之一。 第三部分 自噬与凋亡在低温治疗家兔心肺复苏后脑损伤机制中的相互作用的研究 目的： 探讨自噬在低温治疗心肺脑复苏保护机制中对凋亡影响的研究 方法： 126只雄性新西兰家兔随机分为五组，空白对照组、复苏对照组、低温治疗组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和自噬激活剂雷帕霉素（RAP)组。除空白对照组每组再分为三个亚组，即自主循环恢复（ROSC）后4、9、24h组，除空白对照组为6只家兔外，另四组各时间点均为10只。模型采用经右心室致颤4分钟后复苏模型，低温治疗组在ROSC后立即启动颈部快速降温，目标脑温为32-34℃，维持4h；自噬抑制剂3-MA组和自噬激活剂RAP组用兔脑立体定位仪在复苏前20分钟前给予脑室内注射3-MA（30mg/kg）和RAP(1mg/kg）,并在复苏后予低温治疗，其余各组在诱发VF20分钟前脑室注射生理盐水。应用Western-blotting的方法测定脑组织Bcl-2,caspase-9,caspase-3以及LC3和Beclin-1的表达。并对各组（除空白对照组）ROSC24h进行NDS评分。 结果： 1.复苏对照组ROSC后9,24h Bcl-2、caspase-9、caspase-3、LC3-Ⅱ和Beclin-1表达较空白对照组明显增加（P＜0.05），且复苏对照组24h较9h明显增加（P<0.05）;2.低温治疗组ROSC后9,24h Bcl-2,caspase-9,caspase-3较复苏对照组相应时间点减少（P＜0.05），LC3-Ⅱ和Beclin-1较复苏对照组相应时间点增加（P＜0.05）；3.3-MA组ROSC后9,24h Bcl-2,caspase-9,caspase-3较低温治疗组相应时间点增加（P＜0.05），LC3-Ⅱ和Beclin-1较低温治疗组相应时间点减少（P＜0.05）4.RAP组ROSC后9,24h Bcl-2,caspase-9,caspase-3较低温治疗组相应时间点减少（P＜0.05），LC3-Ⅱ和Beclin-1较低温治疗组相应时间点增加（P＜0.05）。5.ROSC24h复苏组，低温组以及3-MA组NDS评分较差，RAP组NDS评分要好于复苏组（P＜0.05）。 结论： 1.低温性治疗通过抑制凋亡来改善心肺复苏后脑功能损害，挽救更多的脑组织细胞；2.低温性治疗抑制凋亡来保护心肺脑复苏后脑功能，可能与增强自噬的激活的相互调节有关。