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MicroRNA(miRNA)是一类新发现的内源性非编码短链RNA，长度为19～25个核苷酸，可在转录水平或转录后水平调控基因的表达，其主要功能是miRNA与靶基因3′端非翻译区(3′Untranslated region，3′-UTR)结合，并通过降解靶基因或者抑制靶基因翻译来实现转录后的基因沉默。目前已经发现的人类miRNA有700多个左右，调控基因组中大约1/3的蛋白编码基因，广泛参与细胞增殖、分化和凋亡等一系列重要生命过程。近来研究表明，大约有50％已注释的miRNA位于和癌症相关的基因脆性位点及基因组区域中，在癌症中起着原癌基因或者抑癌基因的作用，而且在许多恶性肿瘤包括白血病中已经鉴定出与疾病的诊断、发展、治疗反应及预后相关的miRNA表达谱，本研究团队发表的前期研究工作亦支持这些结果。白血病在我国儿童的恶性肿瘤中发病率最高，而且儿童与成人白血病在生物学特性、治疗反应和预后等方面有明显的不同。然而，目前许多实验都基于对成人白血病的研究，而对儿童白血病相关miRNA的研究较少，很多与儿童急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)和慢性粒细胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia，CML)相关的miRNA未被鉴定。因此，很有必要专门发掘和分析与儿童白血病相关的miRNA，并对其作用和机制进行深入研究，从非蛋白编码基因的分子水平阐明儿童白血病的本质。
本研究收集了68例儿童AML和12例儿童特发性血小板减少性紫癜(作为对照组)的骨髓样本，其中18例儿童初发AML和5例对照组样本用miRNA芯片技术分析miRNA表达谱，50例儿童AML和7例对照组样本用qRT-PCR方法进一步验证miR-99a的表达并分析其功能。另外，亦收集了12例儿童CML骨髓样本用qRT-PCR方法研究miR-99a的表达并分析其功能。结果如下：
(1)miRNA芯片揭示儿童初发AML存在特异性的miRNA表达谱。对18例儿童初发AML和5例对照组样本的576个人类成熟miRNA的表达谱进行分析，筛选并获得了在儿童初发AML中特异高表达的miRNA是miR-99a、miR-100、miR-125b、miR-335和miR-146a等，其中miR-99a的表达在儿童和成人白血病患者中均未见报道。
(2)qRT-PCR技术印证miRNA芯片所显示的miR-99a在儿童初发AML中高表达，并揭示其在不同疾病阶段表达水平不同。qRT-PCR技术显示miR-99a在所有儿童初发AML中高表达，与基因芯片结果一致，而在91％AML CR患者中miR-99a的表达量下降，几乎与对照组的表达相同，在可评估的复发患者中(AML-M2)，miR-99a的表达水平再次升高。同时qRT-PCR技术还显示miR-99a在所有儿童初发CML患者中显著高表达，而在CR患者中表达量下降。这些结果高度提示miR-99a起原癌基因的作用，促进儿童AML和CML的发生和发展。
(3)miR-99a通过调控靶基因CTDSPL和TRIB2发挥原癌基因功能。为研究miR-99a的功能，构建了miR-99a的载体，再通过生物信息学方法，运用TargetScan(http∶//www.targetscan.org/)和PICTAR(pictar.mdc-berlin.de/)生物学软件对miR-99a的靶基因进行正向和反向预测，并结合文献检索，预测出可能与白血病细胞分化与凋亡相关的5个靶基因：TRIB2、CTDSPL、Hoxal、RAC-1、MCL-1。并构建靶基因载体，在293T细胞中通过双荧光报告Lipo转染实验先后筛选并初步证实其中的两个抑癌基因CTDSPL和TRIB2是miR-99a靶基因。然后再选择其中的CTDSPL进行验证，在K562细胞(CML细胞系)中通过双荧光报告电转染实验，结果与双荧光报告Lipo转染实验相符。
(4)对36例儿童AML和3例对照组样本进行Western blot分析，结果表明在对照组和58％的CR患者中CTDSPL蛋白表达较高，而在复发和53％的初发AML患者中CTDSPL蛋白表达较低，与miR-99a的表达呈相反趋势。此外，用100nM miR-99a mimics转染K562和HL60细胞后CTDSPL的表达明显降低。进一步证实CTDSPL蛋白的表达受miR-99a调控，抑癌基因CTDSPL是miR-99a的靶标之一，大部分患者的发病可能与之有关。
(5)MTT实验表明miR-99a明显促进K562和HL60细胞的增殖。双染凋亡实验也提示miR-99a抑制K562和HL60细胞的凋亡。这些结果再次有力揭示miR-99a在儿童AML和CML中起着原癌基因的作用，促进儿童AML和CML的发生和发展。
综上所述，通过研究miR-99a与儿童AML和CML的关系，首次证实了miR-99a在儿童AML和CML中起着原癌基因的作用，抑癌基因CTDSPL和TRIB2是受其调控的其中两个靶基因。该研究从基因调控水平揭示了儿童AML和CML的其中一个新致病机制，为将来开展以miRNA作为药靶治疗白血病的可能性增加了新的理论依据，并为今后进一步探索打下了重要的前期研究基础。