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目的:特发性肺纤维化发病率、致死率较高,是现代医学面临的治疗难题,中医药对其治疗体现出特色和优势。本实验研究即基于肺络理论为指导,结合肺络的生理结构和生理功能特点,系统梳理导师多年临证经验,将特发性肺纤维化归属于肺络病范畴,认为特发性肺纤维化急性发作期的病机是“肺热络瘀”,缓解期的病机是“肺虚络瘀”,并根据“辛以通络”、“虫以通络”、“络虚通补”的用药原则,形成规范化的遣方用药。通过动物体内实验和体外实验,从多角度、多靶点探讨不同时间点中药复方颗粒剂(参龙煎剂)干预IPF TGF-β1/Smads信号传导通路及TH1/TH2细胞因子失衡,全面阐述其延缓特发性肺纤维化的作用机制,为IPF的防治提供科学依据,并奠定新药研制的基础。材料与方法:1.动物体内实验部分1.1采用气管内注入博莱霉素的方法复制大鼠特发性肺纤维化动物模型;1.2本部分实验将120只大鼠按雌雄、体重随机分为六组分六组,每组均20只,即空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松片对照组(简称西药组)、参龙煎剂颗粒剂高剂量组(简称中药高剂量组)、参龙煎剂颗粒剂中剂量组(简称中药中剂量组)、参龙煎剂颗粒剂低剂量组(简称中药低剂量组),根据肺纤维化的病理动态演变规律,分别于7d、14d、28d三个时间点进行实验取材和指标测定;1.3中药复方颗粒剂对IPF模型大鼠的肺组织形态及肺系数影响;观察不同时间点IPF模型大鼠整体状态、肺系数的观察,分析比较各组在整体状态和局部组织的动态演变;通过HE染色、MASSON染色并行病理半定量分析,观察各组大鼠病理组织形态学的动态变化,评价特发性肺纤维化模型制备是否成功和中药复方对其影响。1.4中药复方颗粒剂对IPF模型大鼠羟脯氨酸含量的影响;通过碱水解法测定羟脯氨酸含量,观察不同时间点各组大鼠羟脯氨酸含量的变化情况,评价特发性肺纤维化模型制备是否成功及中药复方颗粒剂对胶原纤维形成和胶原蛋白沉积的影响及治疗作用。1.5中药复方颗粒剂协调IPF模型大鼠THI/TH2细胞因子失衡机制研究通过ELISA、免疫组化、Western-blot法及RT-PCR的方法,多层次、多角度揭示不同时间点血清中IL-4和INF-γ表达,以及肺组织IL-4和INF-γ蛋白和m RNA的动态表达,阐明中药复方颗粒剂协调IPF模型大鼠THI/TH2失衡的机制。1.6中药复方颗粒剂干预IPF模型大鼠TGF-β1/Smads信号传导通路的研究通过免疫组化、Western-blot法及RT-PCR的方法,多层次、多角度揭示不同时间点肺组织TGF-β1、TGFβRII、Smad3、Smad7蛋白和m RNA的动态表达,阐明中药复方颗粒剂调控IPF模型大鼠TGF-β1/Smads信号通路的机制。2.动物体外实验部分2.1采用胰蛋白酶消化法原代提取与培养肺成纤维细胞;2.2肺成纤维细胞共分为5组,即空白组:空白组的血清正常的大鼠肺成纤维细胞+空白组的血清;模型组:模型组大鼠肺成纤维细胞+空白组的血清;抑制剂组:给予TGF-β1抑制剂LY210976的模型组大鼠肺成纤维细胞;西药组:给予西药含药血清干预的模型组大鼠肺成纤维细胞;中药组:给予中药复方颗粒剂含药血清干预的模型组大鼠肺成纤维细胞,并分别并分别于24h、48h、72h三个时间点进行实验指标测定;2.3免疫荧光法检测波形蛋白的表达及定位,判定肺成纤维细胞鉴定成功与否;2.4 MTT比色法检测细胞增殖情况,探讨中药复方颗粒剂含药血清对肺成纤维细胞增殖能力影响;2.5中药复方颗粒剂含药血清干预肺成纤维细胞TGF-β1/Smads信号传导通路的研究通过Western-blot法及RT-PCR的方法,多层次、多角度揭示不同时间点肺成纤维细胞TGF-β1、TGFβRII、Smad3、Smad7蛋白和m RNA的动态表达,阐明中药复方颗粒剂调控肺成纤维细胞内TGF-β1/Smads信号通路的机制。结果:1.动物体内实验部分1.1成功复制大鼠特发性肺纤维化的体内实验动物模型,并摸索出造模方法的优化条件;1.2中药复方颗粒剂明显改善大鼠的一般状态,有效降低肺系数,明显改善改善大鼠IPF整体状态;1.3中药复方颗粒剂能够从病理组织形态上明显减轻大鼠肺组织的炎症程度和纤维化程度,即中药复方颗粒剂可以有效抑制早期肺泡炎,改善中晚期肺内纤维化沉积,尤其是中剂量中药复方颗粒剂在早期抑制炎症效果均优于西药强的松片(P<0.01或P<0.05);1.4中药复方颗粒剂能够从生化方面有效降低羟脯氨酸含量而减轻IPF的程度,即中药中药复方颗粒剂可以抑制HYP,降低肺组织中胶原含量、减少ECM沉积,缓解肺纤维化,与西药组比较,第7d肺组织中羟脯氨酸减少明显(P<0.05);1.5中药复方颗粒剂能够抑制大鼠血清中IL-4表达,促进血清中INF-γ表达,能够抑制大鼠肺组织中肺组织中的IL-4蛋白和IL-4m RNA表达,并促进肺组织中INF-γ蛋白和INF-γm RNA表达,以调解TH1/TH2平衡体系,延缓肺纤维化进程;经药物干预的各组中,与模型对照组比较,西药与中药各剂量组中大鼠血清INF-γ水平均明显上调(P<0.01或P<0.05),IL-4水平则明显降低(P<0.01或P<0.05),提示药物具有促进INF-γ、抑制IL-4的作用。通过比较免疫组化、western blot和RT-PCR法测得的大鼠肺组织内IL-4、INF-γ的蛋白和m RNA检测结果,与血清学检测结果一致,中药中剂量效果略优于西药组。1.6中药复方颗粒剂能够抑制TGF-β1/Smads信号通路中发挥效应的TGF-β1、Tp RII、Smad3蛋白及m RNA的高表达,促进该通路中发挥负性调控效应的Smad7蛋白及m RNA表达上调,发挥调控TGF-β1/Smads信号通路的作用,延缓肺纤维化进程,且中剂量的效果最佳。与空白对照组相比,模型对照组大鼠肺组织中TGF-β1、TGF-βRII、Smad3的蛋白和m RNA表达明显上调(P<0.01或P<0.05),而Smad7蛋白和m RNA表达明显下调(P<0.01或P<0.05),证实Smad3与Smad7竞争性抑制关系;经过药物治疗后,与模型对照组比较,给药各组大鼠肺组织中TGF-β1、TGF-βRII、Smad3的蛋白和m RNA表达均有不同程度的下调(P<0.01或P<0.05),同时Smad7蛋白和m RNA表达也有一定的上调(P<0.01或P<0.05),说明西药强的松片与中药复方颗粒剂组均具有调节Smad3与Smad7竞争性抑制关系作用;与西药组比较,中药中剂量组大鼠肺组织中TGF-β1、TGF-βRII、Smad2、Smad7的蛋白和m RNA表达水平无统计学差异。2.动物体外实验部分2.1成功提取与培养大鼠肺成纤维细胞,并摸索出成纤维细胞提取和培养的条件;2.2中药复方颗粒剂含药血清能够有效抑制肺成纤维细胞增殖能力;2.3中药复方颗粒剂含药血清能够有效抑制肺成纤维细胞内TGF-β1/Smads信号通路中发挥效应的TGF-β1、TGFβRII、Smad3蛋白及m RNA的高表达,促进该通路中发挥负性调控效应的Smad7蛋白及m RNA表达上调,发挥调控TGF-β1/Smads信号通路的作用,延缓肺纤维化进程。结果显示:模型组Fb内源性TGF-β1、TGFβRII、Smad3蛋白和m RNA表达水平明显高于空白组(P<0.01或P<0.05),而Smad7的表达水平则明显低于空白组(P<0.01或P<0.05),证明该模型成功模拟体内肺纤维化过程中Fb激活并上调TGF-β1、TGFβRII、Smad3,下调Smad7蛋白和m RNA表达的过程;抑制剂组Fb内的TGF-β1蛋白水平在第48h、第72h均无统计学差异,说明TGF-β1抑制剂是通过抑制生物活性,不能明显降低其含量;与模型组比较,西药组和中药组Fb内TGF-β1、TGFβRII、Smad3蛋白及m RNA表达水平均明显下调(P<0.01或P<0.05),而Smad7蛋白和m RNA水平上调(P<0.01或P<0.05),抑制剂组Fb内Smad7蛋白和m RNA在三个检测时间水平均明显上调(P<0.01或P<0.05),TGFβRII、Smad3蛋白和m RNA表达有不同程度下调(P<0.01或P<0.05),而TGF-β1蛋白和m RNA的影响不明显。提示两种含药血清均能下调Fb内TGF-β1、TGFβRII、Smad3蛋白及m RNA表达水平,上调Smad7蛋白和m RNA水平,缓解纤维化。与抑制剂组比较,西药组和中药组Fb内TGF-β1m RNA、TGFβRIIm RNA、Smad3及m RNA、samd7及m RNA在各个检测时间均有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而对TGF-β1和TGFβRII蛋白表达差异无统计学意义,提示西药组和中药组对Fb内TGF-β1m RNA、TGFβRIIm RNA、Smad3及m RNA、samd7及m RNA调控作用较明显。结论:1.通过动物体内实验,多角度、多靶点揭示中药复方颗粒剂可能通过协调TH1/TH2细胞因子平衡和调控TGF-β1/Smads信号通路,从而延缓肺纤维化进程;2.通过动物体外实验,揭示中药复方颗粒剂含药血清能够有效抑制肺成纤维细胞增殖能力,调控TGF-β1/Smads信号通路,发挥抗纤维化作用。