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二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid; DHA)属于人体必需的ω-3型多不饱和脂肪酸，哺乳动物自身不能合成，必须从食物中摄取以满足自身的需求。陆地植物DHA含量甚微，而海洋中的鱼类或植物中含量丰富，因此海洋的动植物是获取DHA的理想来源。球等鞭金藻3011属于海洋中的浮游植物，本身具有合成DHA的能力，同时具有生长快、易调控的特点，成为研究和调控DHA的理想实验材料。本研究通过模拟高等植物逆境胁迫的响应机制，采取温度调控的方式，检测了低温对细胞膜的通透性和膜电位变化的影响，以确定藻细胞对温度变化的敏感程度;同时研究了温度对微藻的抗氧化系统，活性氧积累的影响;并利用RT-qPCR方法，研究低温对DHA合成途径中的关键酶表达水平来阐明低温调控DHA含量的方法及其作用机制，为微藻源DHA产业化生产提供理论支持。 1.细胞通透性变化:用碘化丙啶PI、亲脂性阴离子荧光染料DiBAC4(3)、Ca2+敏感型荧光探针Fluo-3/AM标记藻细胞，利用流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测温度调控对细胞膜通透性、膜电位变化和Ca2+离子通透性的影响。结果显示:15-18℃低温诱导20-24h，可使11.17±1.02％的球等鞭金藻3011细胞内荧光强度明显增强、促使膜的通透性发生显著变化（P＜0.05）;同样诱导条件可使38.17±0.13％的细胞膜电位发生改变，具有极显著的变化（P＜0.01）;有58.45±5.59％藻细胞Ca2+通透性发生剧烈变化与对照组比较均具有统计学意义(P＜0.01)。倒置荧光显微镜镜检也与该结果基本一致。说明温度调控可以改变细胞通透性，以低温诱导为主，高温易诱使细胞破裂。 2.细胞抗氧化体系改变:通过15、18、21和24℃温度调控，测定球等鞭金藻超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及还原型谷胱甘肽(GSH)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和藻内活性氧含量，检测温度对球等鞭金藻抗氧化系统和ROS积累与爆发的影响。结果发现:在21℃、18℃和15℃低温处理下，藻细胞SOD、CAT和POD活性均呈现先增加后减小的趋势;温度越低，峰值出现的越早，且峰值越大，同时峰后酶活性下降越快;GSH和MDA含量的变化趋势与上述酶活性的变化相似;ROS水平随着温度的下降而升高，18℃诱导峰值为:14.74±0.58％，与对照组相比具显著变化(P＜0.05)。 3.细胞基因表达量变化:通过设计特异引物序列，对球等鞭金藻3011的脂肪酸去饱和酶基因片段进行筛选，以RT-qPCR技术检测基因的相对表达量，探索低温对多不饱和脂肪酸去饱和酶基因相对表达量的影响。结果表明:随温度的降低酶的表达量均呈现先增加后降低的趋势，相对表达量最大值出现在18℃，Des4、Des5、Des6、Des8、Des9和Des12基因最大表达量分别为4.32、9.32、42.57、9.64、73.91以及5.29。 4.细胞内含物质改变:利用尿素包埋的方法并以DHA甲酯作为标样，气相检测DHA含量:经18℃低温诱导24h，藻细胞DHA含量为0.105mg/g，高于对照组2.3倍，比18℃48h含量高出1.14倍。 根据以上结果说明:球等鞭金藻3011经过18℃低温诱导24h，能够显著提高微藻细胞的DHA含量，其作用机制可能是低温能够使藻细胞膜发生去极化，并在去极化的条件下Ca2+通透性发生改变并活化了NADPH酶，引起自由氧的爆发，激活细胞的主动防御系统，使微藻细胞一方面通过激活抗氧化系统相关酶活性清除多余的ROS，同时ROS作为信号分子，使MAPKs信号通路发生级联放大反应，促使CBF转录因子磷酸化，刺激合成DHA的多不饱和脂肪酸去饱和酶基因的表达，以使细胞适应较低的培养环境。