【摘 要】
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[目的]构建人p16基因第二外显子cDNA克隆,制备其cDNA探针,建立p16基因第二外显子PCR-Southern Blot分析方法.研究原发性肝细胞癌(HCC)p16基因第一、二外显子、p15基因第二外
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[目的]构建人p16基因第二外显子cDNA克隆,制备其cDNA探针,建立p16基因第二外显子PCR-Southern Blot分析方法.研究原发性肝细胞癌(HCC)p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子纯合性缺失,p53基因第七外显子纯合性缺失、点突变以及HBV前C区、S区、X区在HCC中整合情况.[方法]用RT-PCR获得p16基因第二外显子cDNA,将其插入质粒pGEM-T中,构建为重组质粒pGEM-p16.经蓝白选择、限制性内切酶酶切图谱谱分析、DNA序列分析筛选获得重组质粒的阳性克隆,插入片段经限制性内切酶酶切、纯化后,用随机引物法标记地高辛,以此为探针,用Southern Blot方法分析p16第二外显子PCR产物.应用PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLP等方法,对临床38例HCC手术后标本中的p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子、p53基因第七外显子纯合性缺失和点突变进行分析.应用PCR和3末端碱基特异性PCR分析肝细胞癌基因组HBV前C区野生型和突变型、PCR分析S区和X区整合的情况.同时检测了血清中HBV前C区的阳性率.[结论]所获重组质粒为pGEM-p16设计构建,并成功地获得p16第二外显子的cDNA探针和建立了p16 Southern Blot分析方法.所获结果提示在肝细胞癌中p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式,而纯合性缺失不是p15基因在肝细胞癌中的失活方式,但并不排除存在其它失活方式.p53基因第七外显子的杂合性突变提示有肿瘤遗传倾向.未发现纯合性点突变提示在肝细胞癌发生机制中p53基因第七外显子的点突变并不占据主导地位.HBV DNA在原发性肝细胞癌基因组中可能存在整合,并在HCC发生过程中起一定作用.
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