论文部分内容阅读
胆固醇氧化酶(EC1.1.3.6)是微生物代谢类固醇的关键酶，广泛应用于临床胆固醇含量测定、制药工业及食品加工等方面。
本实验室筛选得到一株新菌Streptomyces virginiae IBL-14，具有转化薯蓣皂素生成异纽替皂酮的功能。这是一全新的甾体化合物微生物转化过程，对于研究自然界包括薯蓣皂素在内的甾体化合物转化降解作用具有重要的参考价值。根据代谢过程中分离得到的产物，推测其中有一步反应是由胆固醇氧化酶催化的，但反应的具体途径还没有完全证实。
本研究通过分析链霉菌胆固醇氧化酶氨基酸序列，设计简并引物；以S.virginiae IBL-14的基因组DNA作模板，得到571bp的胆固醇氧化酶基因choL(EU013931)片段。在此基础上，利用链霉菌-大肠杆菌穿梭质粒pKC1139，构建基因敲除质粒pLB002；将在Ecoli ET12567扩增、去甲基化的敲除质粒导入到S.virginiae IBL-14中；在得到的安普霉素抗性转化子中，筛选出发生同源交换的基因敲除菌株；经过PCR验证以及薯蓣皂素生物转化分析，证明该基因被敲除后，S.virginiae IBL-14不能再转化薯蓣皂素生成薯蓣皂酮和异纽替皂酮等化合物，这初步表明胆固醇氧化酶ChoL催化薯蓣皂素生成异纽替皂酮的关键反应，该反应也是薯蓣皂素在S.virginiae IBL-14中代谢的第一步反应。
随后通过染色体走读的方法，设计特异性引物，克隆得到了choL的全长序列，该基因包含开放性阅读框1629bp，编码542个氨基酸，与Streptomyces sp.strain SA-COO同源性为85％。除此之外，在choL上游还发现了一个新的单加氧酶CYP450的部分序列和硫铁氧还蛋白的全部基因(EU224312)序列。
利用pET-22b(+)表达载体，在E.coli BL21(DE3)/plysS中对choL进行异源表达。转化子经IPTG诱导，产生ChoL蛋白经镍亲和层析纯化。得到的ChoL酶活达1.7 U/mg测定条件为37℃，pH7.0)。纯化后的ChoL最适反应温度和pH值分别为45℃和pH7.5。50℃下置放4小时，酶活损失50％，冻存时酶活稳定。最适反应条件下，ChoL对薯蓣皂素的Km为1.95×10-4mol/L，是胆固醇等底物Km值的37.2％。此外，利用异源表达的ChoL转化薯蓣皂素，经HPLC分析，得到薯蓣皂酮，而薯蓣皂酮可进一步被S. virginiae IBL-14转化为异纽替皂酮等衍生物，最终证明ChoL催化薯蓣皂素生成异纽替皂酮代谢途径中的第一步反应。