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在全球范围内，甲状腺恶性肿瘤的发病率逐渐上升，近年来，在某些国家和地区它的发病率已成为内分泌恶性肿瘤的首位。在过去几十年的研究探索中，我们虽然对甲状腺癌发生发展已有了深入的认识，但是，甲状腺癌发生的分子机制至今尚不清楚。为了更进一步地研究甲状腺癌的发生机制和提高甲状腺癌的临床诊治效果，我们需要从基因水平研究其发生发展的分子机制和调控网络。
我们知道基因突变在恶性肿瘤的发生发展过程中，起到了广泛而重要的作用。通过对甲状腺癌中相关癌基因以及其调控的作用机制进行研究，可为甲状腺癌的诊断和治疗提供新的思路和方法，为将来寻找具有治疗效果的个体化治疗分子靶点以及具有预后价值的生物标记物，提供坚实的理论实验基础。
目的：
通过对甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）中的mRNA表达谱研究，筛选出在癌组织和癌旁正常组织间具有显著差异表达的相关基因；对于其中一个差异表达基因NECTIN-4，利用转染siRNA下调其表达量，检测NECTIN-4在甲状腺乳头状癌细胞中的增殖、凋亡和侵袭等生物学行为中的调控作用，观察上皮间充质转化(EMT)相关表型，以确定NECTIN-4在甲状腺乳头状癌细胞系(TPC1、KTC-1和BCPAP)中的特异性作用，为明确NECTIN-4的作用机制。随后通过AKT抑制剂与激动剂拯救试验证明NECTIN-4是通过AKT影响甲状腺乳头状细胞发生EMT改变。进一步探讨和验证NECTIN-4上游的转录因子，以及其与NECTIN-4的相关性和结合位点。
方法：
通过RNA-seq技术对19对配对的甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织进行测序，并在后续整理、过滤以及生物信息学分析中筛选出所有显著差异表达的基因，对测序出来的甲状乳头状癌的转录组相关的基因信息进行深入的研究分析。我们在已筛选出的差异基因中又使用基因本底论以及信号通路分析等方法，通过对甲状腺乳头状癌发生发展过程中涉及的分子机制、信号通路等多个方面中基因所发挥的相关作用进行进一步分析。最终我们选择差异最显著的基因之中的NECTIN-4作为我们的研究对象。在收集的44对甲状腺乳头状癌及相应的癌旁组织组织标本中对NECTIN-4基因mRNA水平表达情况利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）进行检测，在TCGA（The Cancer Genome Atlas）公共数据库的现有数据去验证NECTIN-4在甲状腺乳头状癌组织中的表达。使用整理过的验证组和TCGA数据库的临床病理特征资料，运用统计学分析探索NECTIN-4的表达水平与临床病理特征的关系。随后，我们运用siRNA干扰技术，通过细胞增殖实验和细胞克隆形成实验研究NECTIN-4在细胞株中（TPC1和KTC-1）对细胞增殖能力的影响，通过分子生物学实验来研究NECTIN-4的表达高低在细胞株中对细胞迁移和侵袭能力的影响，通过western-blot实验和细胞免疫荧光实验来研究NECTIN-4对上皮间充质转化(EMT)的影响，验证NECTIN-4在细胞株中的生物学功能。最后，我们通过western-blot实验和激动剂与抑制剂的拯救实验证明：NECTIN-4是通过AKT影响甲状腺癌细胞发生EMT改变。随后用PROMO数据库和GENECARDs数据库对可能调控NECTIN-4基因的转录因子进行预测。维恩分析和预实验预测和证明可能诱导了NECTIN-4的转录的转录因子；随后用RT-qPCR，western-blot实验以及染色质免疫沉淀（ChIP-PCR）实验在细胞株中（TPC1和KTC-1）中进行验证。
结果：RT-qPCR的结果显示，在44对甲状腺乳头状癌及相应的癌旁组织标本以及细胞株中NECTIN-4的表达水平高于癌旁组织（P﹤0.05）。根据NECTIN-4的表达水平中位数将患者分为低和高表达两组，通过临床病理资料分析，发现NECTIN-4表达水平与肿瘤大小(P=0.017),组织学分期（P﹤0.001），组织学类型（P﹤0.001）和淋巴结转移(P﹤0.001)显著相关，提示NECTIN-4可能是一种致癌基因。分子生物学实验发现，在甲状腺乳头状癌细胞株中干扰下调NECTIN-4基因表达之后，其增殖能力显著下降。细胞迁移和侵袭实验表明，下调NECTIN-4基因之后，细胞株迁移和侵袭能力被抑制并且细胞凋亡增多。而western-blot实验和细胞免疫荧光实验则证明了敲除NECTIN-4可降低N-cadherin，vimentin和EZH2的表达并上调E-cadherin，提示NECTIN-4可能通过改变EMT调控甲状腺乳头状癌的转移。
为了探索NECTIN-4是如何影响甲状腺乳头状癌细胞发生EMT改变，我们通过western-blot实验发现了NECTIN-4是通过活化AKT来影响其下游EMT通路蛋白发生变化。并且通过AKT激活剂（SC79）与AKT抑制剂（LY294002）进行了细胞增殖，迁移和侵袭实验，证明了NECTIN-4导致EMT通路发生改变是通过AKT这一关键分子引起的。这些结果表明AKT可能是NECTIN-4潜在的下游靶点。拯救实验（rescue experiments）验证了激活AKT能够逆转敲除NECTIN-4对细胞功能的影响，提示AKT是NECTIN-4相关细胞增殖、转移和EMT的重要介导因子。维恩分析和预实验表明转录因子SP1可能诱导了NECTIN-4的转录，TCGA数据库分析发现SP1与NECTIN-4表达呈正相关,相关系数R=0.24（P＜0.001）。在甲状腺癌细胞株中（TPC1和KTC-1），干扰下调SP1基因表达后，NECTIN-4基因表达显著下降，干扰下调SP1基因表达后，Western bolt实验同样表明NECTIN-4蛋白表达水平也明显下降；我们进一步利用ChIP-PCR来验证发现SP1可以直接结合在NECTIN-4基因转录启始点上游3000bp和8000bp位置，从而诱导NECTIN-4的转录。
结论：本研究利用生物信息学和转录组测序找出NECTIN-4基因作为研究对象，发现NECTIN-4在甲状腺乳头状细胞中表达显著上调，其表达水平与肿瘤的大小，组织学分期，组织学分型和淋巴结转移具有显著联系，可能能够作为潜在的诊断分子标记物。在细胞学实验中发现，通过干扰下调NECTIN-4的表达，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并抑制了EMT的发生。以AKT作为可能的下游靶点进行了拯救实验，并验证了这一猜想。我们进一步通过数据库和相关分子生物学实验发现转录因子SP1参与诱导NECTIN-4的转录；本研究证明了NECTIN-4作为一个抑癌基因在甲状腺乳头状癌中的重要作用，并对其在甲状腺乳头状癌的发生发展的基因调控机制进行初步的探索。
我们知道基因突变在恶性肿瘤的发生发展过程中，起到了广泛而重要的作用。通过对甲状腺癌中相关癌基因以及其调控的作用机制进行研究，可为甲状腺癌的诊断和治疗提供新的思路和方法，为将来寻找具有治疗效果的个体化治疗分子靶点以及具有预后价值的生物标记物，提供坚实的理论实验基础。
目的：
通过对甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）中的mRNA表达谱研究，筛选出在癌组织和癌旁正常组织间具有显著差异表达的相关基因；对于其中一个差异表达基因NECTIN-4，利用转染siRNA下调其表达量，检测NECTIN-4在甲状腺乳头状癌细胞中的增殖、凋亡和侵袭等生物学行为中的调控作用，观察上皮间充质转化(EMT)相关表型，以确定NECTIN-4在甲状腺乳头状癌细胞系(TPC1、KTC-1和BCPAP)中的特异性作用，为明确NECTIN-4的作用机制。随后通过AKT抑制剂与激动剂拯救试验证明NECTIN-4是通过AKT影响甲状腺乳头状细胞发生EMT改变。进一步探讨和验证NECTIN-4上游的转录因子，以及其与NECTIN-4的相关性和结合位点。
方法：
通过RNA-seq技术对19对配对的甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织进行测序，并在后续整理、过滤以及生物信息学分析中筛选出所有显著差异表达的基因，对测序出来的甲状乳头状癌的转录组相关的基因信息进行深入的研究分析。我们在已筛选出的差异基因中又使用基因本底论以及信号通路分析等方法，通过对甲状腺乳头状癌发生发展过程中涉及的分子机制、信号通路等多个方面中基因所发挥的相关作用进行进一步分析。最终我们选择差异最显著的基因之中的NECTIN-4作为我们的研究对象。在收集的44对甲状腺乳头状癌及相应的癌旁组织组织标本中对NECTIN-4基因mRNA水平表达情况利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）进行检测，在TCGA（The Cancer Genome Atlas）公共数据库的现有数据去验证NECTIN-4在甲状腺乳头状癌组织中的表达。使用整理过的验证组和TCGA数据库的临床病理特征资料，运用统计学分析探索NECTIN-4的表达水平与临床病理特征的关系。随后，我们运用siRNA干扰技术，通过细胞增殖实验和细胞克隆形成实验研究NECTIN-4在细胞株中（TPC1和KTC-1）对细胞增殖能力的影响，通过分子生物学实验来研究NECTIN-4的表达高低在细胞株中对细胞迁移和侵袭能力的影响，通过western-blot实验和细胞免疫荧光实验来研究NECTIN-4对上皮间充质转化(EMT)的影响，验证NECTIN-4在细胞株中的生物学功能。最后，我们通过western-blot实验和激动剂与抑制剂的拯救实验证明：NECTIN-4是通过AKT影响甲状腺癌细胞发生EMT改变。随后用PROMO数据库和GENECARDs数据库对可能调控NECTIN-4基因的转录因子进行预测。维恩分析和预实验预测和证明可能诱导了NECTIN-4的转录的转录因子；随后用RT-qPCR，western-blot实验以及染色质免疫沉淀（ChIP-PCR）实验在细胞株中（TPC1和KTC-1）中进行验证。
结果：RT-qPCR的结果显示，在44对甲状腺乳头状癌及相应的癌旁组织标本以及细胞株中NECTIN-4的表达水平高于癌旁组织（P﹤0.05）。根据NECTIN-4的表达水平中位数将患者分为低和高表达两组，通过临床病理资料分析，发现NECTIN-4表达水平与肿瘤大小(P=0.017),组织学分期（P﹤0.001），组织学类型（P﹤0.001）和淋巴结转移(P﹤0.001)显著相关，提示NECTIN-4可能是一种致癌基因。分子生物学实验发现，在甲状腺乳头状癌细胞株中干扰下调NECTIN-4基因表达之后，其增殖能力显著下降。细胞迁移和侵袭实验表明，下调NECTIN-4基因之后，细胞株迁移和侵袭能力被抑制并且细胞凋亡增多。而western-blot实验和细胞免疫荧光实验则证明了敲除NECTIN-4可降低N-cadherin，vimentin和EZH2的表达并上调E-cadherin，提示NECTIN-4可能通过改变EMT调控甲状腺乳头状癌的转移。
为了探索NECTIN-4是如何影响甲状腺乳头状癌细胞发生EMT改变，我们通过western-blot实验发现了NECTIN-4是通过活化AKT来影响其下游EMT通路蛋白发生变化。并且通过AKT激活剂（SC79）与AKT抑制剂（LY294002）进行了细胞增殖，迁移和侵袭实验，证明了NECTIN-4导致EMT通路发生改变是通过AKT这一关键分子引起的。这些结果表明AKT可能是NECTIN-4潜在的下游靶点。拯救实验（rescue experiments）验证了激活AKT能够逆转敲除NECTIN-4对细胞功能的影响，提示AKT是NECTIN-4相关细胞增殖、转移和EMT的重要介导因子。维恩分析和预实验表明转录因子SP1可能诱导了NECTIN-4的转录，TCGA数据库分析发现SP1与NECTIN-4表达呈正相关,相关系数R=0.24（P＜0.001）。在甲状腺癌细胞株中（TPC1和KTC-1），干扰下调SP1基因表达后，NECTIN-4基因表达显著下降，干扰下调SP1基因表达后，Western bolt实验同样表明NECTIN-4蛋白表达水平也明显下降；我们进一步利用ChIP-PCR来验证发现SP1可以直接结合在NECTIN-4基因转录启始点上游3000bp和8000bp位置，从而诱导NECTIN-4的转录。
结论：本研究利用生物信息学和转录组测序找出NECTIN-4基因作为研究对象，发现NECTIN-4在甲状腺乳头状细胞中表达显著上调，其表达水平与肿瘤的大小，组织学分期，组织学分型和淋巴结转移具有显著联系，可能能够作为潜在的诊断分子标记物。在细胞学实验中发现，通过干扰下调NECTIN-4的表达，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并抑制了EMT的发生。以AKT作为可能的下游靶点进行了拯救实验，并验证了这一猜想。我们进一步通过数据库和相关分子生物学实验发现转录因子SP1参与诱导NECTIN-4的转录；本研究证明了NECTIN-4作为一个抑癌基因在甲状腺乳头状癌中的重要作用，并对其在甲状腺乳头状癌的发生发展的基因调控机制进行初步的探索。