【摘 要】
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河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种小分子非蛋白毒素,毒性极强,人畜误食后均能致死。TTX是典型的钠离子通道抑制剂,中毒者出现肢体麻木、瘫痪等症状,严重的可导致死亡。TTX人
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河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一种小分子非蛋白毒素,毒性极强,人畜误食后均能致死。TTX是典型的钠离子通道抑制剂,中毒者出现肢体麻木、瘫痪等症状,严重的可导致死亡。TTX人体致死剂量约为0.5mg/70kg。缺乏简单有效的检测方法。在本研究中,我们获得了用于制备TTX检测试剂盒的基因工程单链抗体,对TTX进行检测。TTX为小分子物质,分子量仅有319.26,本身只有反应原性,不具免疫原性。若直接以其进行动物免疫,不能产生免疫效果。将TTX与钥孔傶血兰蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)通过化学方法连接构成具有免疫原性的完全抗原,作为小鼠免疫用抗原;将TTX与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)通过化学方法连接,作为检测用抗原。选取6-8周龄,健康的Balb/c小鼠雌性小鼠作为免疫动物进行免疫,加强免疫数次后,测小鼠血清中anti-TTX抗体效价。当血清效价达到一定值后,取效价最高的小鼠,处死后提取脾脏总RNA。提取的RNA经检测后,通过RT-PCR获得cDNA第一链。以上述cDNA为模板,经PCR得到抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL,以编码(Gly4Ser)3的核苷酸序列作为linker,通过交错延伸PCR将VH和VL基因组装为完整的scFv基因。将scFv基因克隆入噬菌体载体pCANTAB-5E中,构建了噬菌体单链抗体库。经过6轮淘选,最终从噬菌体抗体库中筛选到一株亲和力较高的单链抗体WY5。
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