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目的:课题组前期动物实验发现逍遥散可以抑制肝气郁结造成的结肠癌肝转移,同时能降低血清中肾上腺素和去甲肾上腺素的水平并减少肿瘤组织中巨噬细胞的浸润程度。本课题基于中医理论知识,重点利用小鼠结肠癌转移瘤模型,从体内和体外实验多角度,采用流式细胞术、免疫荧光、细胞共培养、酶联免疫吸附实验、实时荧光定量核酸扩增等方法考察逍遥散在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)调控人结肠癌转移中的作用;明确逍遥散通过β肾上腺素信号通路调控TAMs抑制结肠癌转移的机制,验证逍遥散增加M1型巨噬细胞极化的比例,促进巨噬细胞释放免疫因子,增加巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的活性,以及明确极化的巨噬细胞抑制肿瘤转移的作用机制。方法:1.采用小鼠尾静脉转移瘤模型,记录小鼠体重情况观察其生存质量;运用小动物活体成像技术检测肿瘤模型小鼠的肿瘤转移情况,观察逍遥散对结肠癌转移的影响;采用FACS检测小鼠血液以及脾脏中巨噬细胞表面分子CD86和F4/80的表达;2.采用PMA将人单核细胞株THP-1诱导为M0型巨噬细胞,再挑选合适浓度的干扰素-γ(IFN-γ)、脂多糖(LPS)将M0型巨噬细胞诱导成M1型巨噬细胞;采用MTT法检测逍遥散含药血清处理过的巨噬细胞对肿瘤细胞活性的影响;PCR检测i NOS及TNF-α基因表达;ELISA检测IL-6及TNF-α等细胞因子的分泌;3.采用PCR技术检验β肾上腺素受体在THP-1、M0、M1中的表达变化,采用细胞毒性试验观察β肾上腺素受体的激动剂和抑制剂对M1型巨噬细胞杀伤作用的调控。采用PCR和ELISA试验检测M1型巨噬细胞标志物TNF-α的表达和分泌。采用慢病毒载体介导的RNA干扰技术,沉默THP-1细胞ADRB2基因,利用荧光显微镜、PCR、流式细胞术技术验证基因敲除效率;采用PCR的技术检测基因沉默后M1型巨噬细胞标志基因的表达;4.采用PCR技术检测逍遥散组与生理盐水组小鼠肿瘤中ADRB2基因的表达,及逍遥散作用后M1巨噬细胞ADRB2基因的表达变化;采用MTT细胞活性试验观察逍遥散是否能够逆转β肾上腺素受体的激动剂对M1型巨噬细胞杀伤作用的抑制,采用流式细胞术检测逍遥散能否逆转β肾上腺素受体的激动剂作用后M1型巨噬细胞比例的降低;采用流式细胞术和ELISA检测ADRB2基因沉默后逍遥散对M1型巨噬细胞的作用的比例变化和标志细胞因子的分泌;采用PCR检测逍遥散是否影响THP-1细胞ADRB2受体的表达;采用Fluo4染色检测逍遥散是否影响THP-1细胞ADRB2受体的活化;采用PCR技术检测ADRB2基因沉默后其下游信号通路基因表达的变化;逍遥散作用于ADRB2基因沉默的M1型巨噬细胞,检测其下游信号通路的激活。结果:1.活体成像显示逍遥散组的小鼠结肠癌转移明显降低,且肿瘤的荧光强度明显低于生理盐水对照组(P<0.05);流式细胞术结果表明逍遥散组小鼠的脾脏和血液中的M1型巨噬细胞明显升高(P<0.001;P<0.01);2.成功诱导人外周血单核细胞系THP-1使其分化为巨噬细胞,并挑选最合适干扰素-γ(IFN-γ)、脂多糖(LPS)的诱导浓度建立M1型巨噬细胞模型;逍遥散组的M1型巨噬细胞对结肠癌细胞的杀伤率明显高于对照组(P<0.05);逍遥散组M1型巨噬细胞分泌的标志性细胞因子TNF-α和IL-6明显增多;(P<0.001;P<0.01);逍遥散组的M1型巨噬细胞TNF-α和INOS基因的表达明显升高(P<0.05);3.β肾上腺素受体基因ADRB2在THP-1逐渐诱导为M1型巨噬细胞的过程中表达逐渐降低(P<0.05);肾上腺素和异丙肾上腺素组作用M1型巨噬细胞的上清对肿瘤细胞杀伤率降低(P<0.05;P<0.01);普萘洛尔组的M1型巨噬细胞TNF-α的表达明显升高(P<0.05),且对肿瘤细胞杀伤率提高(P<0.01);肾上腺素和异丙肾上腺素作用后M1型巨噬细胞的标志物TNF-α的表达和分泌明显降低(P<0.001;P<0.01);成功构建sh-ADRB2和sh-CTRL的THP-1细胞株;基因沉默后M1型巨噬细胞标志物TNF-α和INOS基因的表达明显升高(P<0.05)。4.逍遥散组小鼠肿瘤中ADRB2的表达较生理盐水组明显降低(P<0.05),逍遥散作用于M1型巨噬细胞后ADRB2基因表达明显降低(P<0.05);逍遥散与β肾上腺素受体的激动剂联合作用时可以明显逆转激动剂的杀伤抑制作用(P<0.05),并且其联合作用明显逆转激动剂所降低的M1型细胞的比例;逍遥散作用于ADRB2基因沉默的THP-1所诱导的M1型巨噬细胞时,其M1型巨噬细胞的比例无明显变化,其标志细胞因子的分泌无明显差异。逍遥散明显降低THP-1细胞的ADRB2基因的表达,不影响ADRB2受体活化;ADRB2基因沉默后其下游PTEN/PI3K/AKT/RICTOR信号通路激活,从而促进极化(P<0.05);当逍遥散作用于ADRB2基因未沉默的细胞时,起到了相同的促进极化的作用(P<0.05),当逍遥散作用于ADRB2基因沉默的M1型巨噬细胞时,其促进极化的作用消失。结论:逍遥散可以明显抑制小鼠体内结肠癌的增殖及转移,其机制是逍遥散通过下调β肾上腺素信号通路的ADRB2基因表达使M1型巨噬细胞极化加强,进而促进对肿瘤的杀伤,抑制结肠癌的转移。