论文部分内容阅读
目的:1.观察扶肾颗粒对TGF-β1诱导的体外纤维化模型的干预作用;2.探讨扶肾颗粒干预腹膜纤维化进程的可能作用机制。方法:1.扶肾颗粒含药血清制备:实验培养50只SD雄性大鼠,25只灌胃扶肾颗粒,25只灌胃生理盐水做为空白组。灌胃7天后腹主动脉取血,离心取含药血清。体外培养人腹膜间皮细胞株（HMr SV5）,将细胞分为五组:（1）空白组:M199培养基+10%空白血清;（2）模型组:M199培养基+10%空白血清+TGF-β1（10ng/ml）;（3）含药血清组:M199培养基+TGF-β1+10%扶肾颗粒含药血清;（4）BMP7组:M199培养基+10%空白血清+TGF-β1+BMP7（100ng/ml）;（5）Gremlin组:M199培养基+TGF-β1+10%扶肾颗粒含药血清+Gremlin（400ng/ml）。通过CCK-8细胞活性检测,确定扶肾颗粒含药血清最适宜浓度。2.显微镜下直观观察TGF-β1干预后腹膜间皮细胞形态改变以及用免疫荧光检测腹膜间皮细胞E-cadherin、ZO-1的表达确定是否造模成功。免疫印迹法（Western Blot）检测腹膜间皮细胞EMT的相关指标E-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的蛋白表达;免疫荧光观察腹膜间皮细胞EMT的相关因子指标FN、α-SMA的表达;实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测腹膜间皮细胞EMT的相关因子指标E-cadherin、FN、α-SMA、Vimentin的m RNA表达。WB检测腹膜间皮细胞BMP7/Gremlin通路相关因子指标TGF-β1、BMP7、Gremlin、P-smad1/5/9的蛋白表达;PCR检测腹膜间皮细胞BMP7/Gremlin通路相关指标TGF-β1、BMP7、Gremlin的m RNA表达。结果:1.显微镜镜下显示:加入TGF-β1药物干预后,细胞形态变长成梭形,呈纤维样改变;免疫荧光观察结果显示:与空白组腹膜间皮细胞相比,TGF-β1干预后,E-cadherin和ZO-1蛋白表达降低,说明EMT形成,造模成功。2.Western Blot结果:与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞FN、α-SMA、Vimentin蛋白表达水平均显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组FN、α-SMA、Vimentin蛋白表达水平均有不同程度降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＞0.05）。与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞E-cadherin蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组E-cadherin蛋白表达水平有不同程度升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。免疫荧光结果:空白组腹膜间皮细胞细胞外基质中FN蛋白呈低表达情况,模型组细胞在经过TGF-β1刺激后FN表达显著升高,扶肾颗粒干预可明显降低FN蛋白在腹膜间皮细胞细胞外基质中的表达。空白组腹膜间皮细胞内α-SMA蛋白呈低表达情况,模型组细胞在经过TGF-β1刺激后α-SMA表达显著升高,扶肾颗粒干预可明显降低α-SMA蛋白在腹膜间皮细胞内的表达。PCR结果:与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞FN、α-SMA、Vimentin的m RNA相对表达水平均显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组FN、α-SMA、Vimentin的m RNA表达水平均有不同程度降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＞0.05）。与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞E-cadherin的m RNA相对表达水平显著降低（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组E-cadherin的m RNA相对表达水平有不同程度升高（P＜0.01,P＜0.001）。3.Western Blot结果:与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞TGF-β1、Gremlin的蛋白相对表达水平均显著升高（P＜0.001）;而与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组TGF-β1、Gremlin的蛋白相对表达水平均有不同程度降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＞0.05）。与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞BMP7、P-smad1/5/9蛋白表达水平均显著降低（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组BMP7、P-smad1/5/9的蛋白相对表达水平均有不同程度升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＞0.05）。PCR结果:与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞TGF-β1、Gremlin的m RNA表达水平均显著升高（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组TGF-β1、Gremlin的m RNA表达水平均有不同程度降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＞0.05）。与空白组相比,模型组腹膜间皮细胞BMP7的m RNA表达水平显著降低（P＜0.001）;与模型组相比,含药血清组、BMP7组、Gremlin组BMP7的m RNA表达水平有不同程度升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。结论:扶肾颗粒能够减少腹膜细胞的细胞外基质生成,抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞纤维化进展,其作用机制可能与其调控BMP7/Gremlin信号通路,进而调控EMT进程相关。