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造血干细胞(HSC)已被广泛应用于干细胞移植、生物免疫治疗、细胞治疗和基因治疗等领域，但细胞来源和数量不足一直是限制其应用的瓶颈问题。尽管造血干细胞体外扩增可望解决这一问题，但是到目前为止体外培养环境还难以避免干细胞功能的丧失。所以，如何在体外模拟骨髓造血微环境，以确保造血干细胞在扩增的同时维持其应有的生物学功能，是突破上述瓶颈问题的关键所在。
氧分压(pO2)是造血干细胞体外培养过程的关键参数，在常规培养体系中可达21％，而在骨髓造血微环境中一般只维持在5％左右。活性氧物质(ROS)是细胞内氧代谢的副产物，其水平受到培养环境中氧分压的调节，并可作为信号分子在调控细胞的氧化应激、增殖、分化、衰老及凋亡等一系列生理活动中发挥重要作用。然而，目前在造血干细胞体外培养过程中，人们对胞外氧分压、胞内活性氧和造血干细胞扩增特性之间的内在关系并不清楚。为此，本文以胞内的活性氧水平为切入点，通过研究氧分压对造血干细胞体外扩增特性和生理功能的影响，认识胞内活性氧水平在其中发挥的重要作用及其调控机制，从而为优化造血干细胞体外培养环境、建立有利于其扩增和功能维持的体外培养过程提供科学指导。
本文首先考察了氧分压对脐血CD34+造血干/祖细胞胞内ROS水平和细胞扩增特性的影响，并在体外培养过程中，分别采用超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)3种抗氧化剂降低细胞内的ROS水平，研究CD34+细胞在使用抗氧化剂清除ROS后的体外扩增特性。结果表明，细胞因子会刺激胞内ROS水平的上升，氧分压能调控胞内ROS的生成，氧分压越高，胞内ROS水平越高。5％pO2有利于保持扩增后CD34+细胞的干/祖细胞的特性，包括提高培养物中CD34+细胞、CD34+CD38-细胞的比例和集落生成细胞的密度；1％pO2则能够完全抑制ROS的生成和CD34+细胞的扩增能力。所使用的3种抗氧化剂均能有效地清除胞内ROS，且清除程度随使用剂量的增加而增加。当在21％pO2的培养体系中添加低剂量的抗氧化剂后，细胞内的ROS水平和细胞的扩增特性与5％pO2的培养体系相同；而添加高剂量的抗氧化剂后，则能够完全清除生成的ROS并抑制CD34+细胞的扩增能力。可见，CD34+细胞的扩增特性受到了胞内ROS水平的影响，而氧分压可以通过调节细胞内的ROS水平来影响造血干/祖细胞的体外扩增特性。
为了探求氧分压对胞内ROS水平的调控作用，本文进一步研究了氧分压对胞内ROS产生和清除的影响机制。细胞质膜上的NADPH氧化酶是细胞产生ROS的重要部位之一，实验结果表明，与常氧(21％pO2)相比，低氧分压能降低细胞内NADPH氧化酶的mRNA表达水平、NADPH氧化酶调节性亚基p67蛋白的表达水平以及NADPH氧化酶的酶活水平。当在21％pO2的培养体系中添加了NADPH氧化酶的抑制剂二联苯碘(DPI)后，发现能显著降低细胞内ROS水平，并且有利于保持扩增后CD34+细胞的干/祖细胞的特性。由此可见，在CD34+细胞的培养过程中胞内ROS水平受到NADPH氧化酶的调节，而氧分压则主要通过调节细胞质膜上的NADPH氧化酶对胞内ROS的生成发挥调控作用。通过考察氧分压对胞内抗氧化酶以及谷胱甘肽抗氧化体系的影响，结果发现，与常氧(21％pO2)培养条件相比，低氧(5％pO2)条件降低了细胞内GPX的酶活水平，提高了胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的含量以及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比例。在常氧培养条件下添加GSH前体NAC能降低细胞的过氧化状态至低氧分压水平。上述实验结果说明，随着培养环境中氧分压的升高，细胞会调动胞内的GSH-GPX抗氧化体系来清除多余的活性氧，以降低细胞的过氧化状态。
在上述研究工作基础上，本文使用Oligo造血干细胞及造血功能基因芯片从分子水平上进一步研究了氧分压对扩增后CD34+CD38-造血干细胞功能基因表达的影响。实验从新鲜脐血中分离CD34+CD38-造血干细胞，分别在常氧(21％pO2)、低氧(5％pO2)和添加NAC(21％pO2添加低剂量的NAC)3种培养条件下培养7天后，再通过富集CD34+CD38-造血干细胞进行基因芯片分析。从实验获得的基因表达散点图中可见，低氧组或NAC组细胞与新鲜组细胞的相关系数均高于常氧组与新鲜组细胞的相关系数；而且与常氧组相比，低氧组或NAC组细胞的基因表达图谱更接近于新鲜组细胞。这一发现进一步从分子水平上证明低氧分压或降低胞内的ROS水平有利于保持扩增后造血干细胞的功能特性。另外，通过基因比对发现，低氧组与常氧组相比除了1个基因上调外，有22个基因下调，NAC组与常氧组相比，除了1个基因上调外，有29个基因下调，这些下调的基因主要与细胞因子、定系细胞的表面标志以及血细胞分化相关。由此可见，低氧分压或降低胞内的ROS水平下调的是培养过程中与造血干细胞分化相关的基因。进一步通过定量PCR检测和定向诱导分化实验发现，与常氧组相比，低氧组和NAC组细胞下调了与树突状细胞成熟相关的CD80、CD86和JAG1基因表达，并且抑制了培养后的CD34+CD38-造血干细胞向成熟树突状细胞分化的能力，但对诱导后的成熟树突状细胞功能并无明显影响。
由此可见，体外培养环境中氧分压对造血干细胞扩增、分化及其生物学功能的影响主要与胞内ROS水平有关。低氧分压能通过调节细胞质膜上的NADPH氧化酶减少胞内ROS的生成，降低细胞的过氧化状态并下调培养过程中与造血干细胞分化相关的基因，从而有利于保持扩增后造血干细胞的生物学功能。通过研究ROS在氧分压影响造血干细胞体外扩增过程中的核心调控作用将有助于深入理解氧分压与造血干细胞生物学特性之间的联系，为优化体外培养参数、减少培养环境导致细胞的氧化应激损伤、扩增具有生物学功能的造血干细胞及血细胞奠定理论基础。