论文部分内容阅读
全球人口的迅速增长,迫切需要替代性的蛋白质来源。因此,昆虫被列为一个潜在资源,黑水虻（H.illucens,HIL）由于含有丰富的蛋白质含量,并能转化废弃有机质,对环境有利。在未来20-30年内,人类可能会依赖昆虫蛋白。从食用昆虫中提取组成蛋白/制备蛋白水解物以用于新型食品应用,是一种很有前途的方法。在这方面,进行工业化应用的成功取决于提高产量、功能和/或提高生物活性的工艺条件。因此,需要测定这些新的分离蛋白的功能性,以确定它们在食品配方中的潜在用途。为了获得蛋白质分离物/水解物,可以采用传统和新的提取及水解技术。这些技术的应用可能对产物（分离物和水解物）产生不同的影响,从而影响其功能性、生物活性和在食品配方中的应用。传统的提取和水解工艺,已经在工业上被广泛应用许多年了。然而,最近有文献证明,超声波等新技术在提高产品活性和提取率,同时降低酶消耗、生产成本和确保最终产品质量方面具有潜在的用途。然而,也有报道指出,超声波可能会损害蛋白质的某些功能特性。为此,本研究主要研究常规（碱性辅助提取）和超声处理对对黑水虻幼虫蛋白质和水解液的功能性和生物活性（体外抗氧化性）的影响。研究的主要内容和结果如下:（1）研究了从黑水虻幼虫中提取蛋白质的方法。研究了用从HIL中提取蛋白质的最佳工艺,并对分离蛋白的氨基酸组成、理化/功能性质进行了测定和比较。之后,研究了超声参数对提取率的影响。将Box-Behnken的Box-Wilson设计方法应用于优化过程。在单因素研究之后,相关分析表明多项式模型可以用来说明提取参数对蛋白质产量的影响。响应面图显示提取变量对黑水虻蛋白产量有影响（p<0.05）。在时间59.43分钟,碱溶液-样品比为24.85:1.00,温度52.23℃的最佳提取条件（OP）下,蛋白质最高得率为64.44%。与修改模型（MP,条件:60 min,碱液-样品比15:1,40℃）相比,OP提取的蛋白质含量分别为80.42±0.90%和76.91±0.91%（p<0.05）。氨基酸（AA）评分高于FAO参考值。OP和MP提取物对提取蛋白质的影响存在差异,与内源荧光/AA值一致。超声参数对蛋白质得率的影响表明,在40±2 kHz、30 min、109 W/L、25:1（溶剂-样品比）50℃、500 ms、脉冲工作间歇比15/5 s的条件下,超声预处理可以使蛋白提取率提高20.31%。（2）研究了在不同的酶浓度和温度下,超声波作用对食用昆虫蛋白（HILMP）的酶解反应的影响,以解释研究了超声处理对反应效率,分子构象,动力学极限和自由吉布斯能以及抗氧化能力的作用机理。对照组相比较,结果表明,在不同的酶体积和温度下,超声化学处理提高了HILMP的酶解效率。酶解动力学表明,在323、313、303和293 K时,超声处理使速率常数分别提高了17.21、25.06、26.91和41.38%（p<0.05）。在吉布斯自由能上,超声处理使反应物的反应能、焓和熵分别降低了30.53、35.05和10.71%（p<0.05）。紫外光谱、荧光光谱和显微图像的变化表明超声处理后HILMP发生了改变。与对照组相比,超声处理的HILMP抗氧化活性增强。（3）采用常规、定频和扫频三种预处理方式制备了食用昆虫（黑水虻）幼虫蛋白和水解液。并对分离物和水解物的氨基酸（AA）组成、抗氧化活性和功能特性进行了研究。碱性蛋白酶水解显著提高了蛋白质的溶解度,但降低了乳化性能和起泡稳定性。与传统方法相比,经超声波处理的分离物和水解物具有最高的抗氧化作用,在宽（2-12）pH范围内具有良好的溶解度和泡沫膨胀性。超声波,特别是扫频模式超声波处理后的水解物总的显示出比其余模式和分离物更好的溶解性、泡沫和抗氧化（ABTS、超氧化物清除和铁还原）能力（p<0.05）。处理方式影响水解物和分离物的功能特性和抗氧化能力。（4）研究了常规和混合频率超声处理对可食性昆虫（黑水虻）幼虫蛋白质样品和水解产物的结构,物理和功能特征的影响。酶解（特别是超声辅助）与对照相比,样品的亮度降低不明显（p>0.05）。相对于对照组,超声处理（特别是扫频）分离物和水解物显示出有更高的巯基、可重构性功能（pH 2-10）、表面电荷（p<0.05）和吸油率（p>0.05）;浊度、粒径（p<0.05）和吸水率（p>0.05）降低。通过SDS-PAGE对蛋白分离物进行了表征,其分子量较高,而水解产物的分子量较低（无明显差异）。通过数值分析,水解产物（尤其是超声处理的）显示出明显较低的分子量（<1000 Da）。解卷积的FTIR光谱（α螺旋、β-折叠/转角、无规卷曲分数）和UV光谱分析表明了样品中的差异。超声处理可能会影响蛋白可变结构进而其影响功能。（5）研究了超声波处理条件对黑水虻幼虫蛋白水解液抗氧化活性的影响。应用三因素三水平（pH 7–9、时间10–30 min和温度25–55℃）Box-Behnken设计优化超声处理条件。以铁离子螯合活性（ICA）、DPPH自由基清除能力（DPPHRSA）、羟基自由基清除能力（HRSA）和铜离子螯合能力（CCA）为响应值。结果表明,酶解前的超声处理对ICA、DPPHRSA、HRSA和CCA有显著影响。方差分析表明,测定系数（R2）分别为0.98（ICA）、0.99（DPPHRSA）、0.98（HRSA）和0.88（CCA）,模型与实验结果吻合较好。最佳超声条件为pH 9、时间29.84 min、温度54.93℃。在最佳条件下,得到的实验数据ICA 37.84%、DPPHRSA 43.19%、HRSA 71.01%和CCA 68.93%,与预测值一致,且高于对照组（传统方法）。（6）研究了冷冻干燥（FD）、微波干燥（MD）、烘箱干燥（OD）和FD与MD联合脱水（FMD）工艺对黑水虻幼虫（HIL）分离蛋白抗氧化活性（混合浓度）、理化性质、功能特性和结构特征的影响。FD-HIL分离物的吸水率、溶解度（pH 2-12）、粒度和褐变指数均较MD、OD和FMD有所提高（p<0.05）。FMD使分离物的抗氧化能力和吸油功能得到改善（p<0.05）。分离物的基本结构单元和相关光谱数据:荧光、红外、圆二色谱（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲）表明样品中存在差异。因此,蛋白质制备中HIL脱水技术可以基于期望的功能性进行选择。