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1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，作为增塑剂、洗涤剂、防腐剂、乳化剂、耐高压润滑剂、染料、油墨、防冻剂、抗冻剂、融雪剂等被广泛的应用于食品、化妆品、纺织、印染、医药、涂料等行业。同时，1，3-丙二醇也是合成聚酯纤维(PTT)的主要单体。据资料统计，2001年全世界1，3-丙二醇年生产能力仅为13.6万吨，远远不能满足市场需求，且价格昂贵。目前，我国1，3-丙二醇产量非常少，大宗工业用1，3-丙二醇仍需进口。因此，开发具有我国自主知识产权的1，3-丙二醇生产技术对推动我国PTT材料和其它相关行业的发展具有十分重要的意义。
目前1，3-丙二醇的生产主要采用化学合成法和微生物发酵法。但由于微生物发酵法自身无法克服的弊端，如发酵周期长、发酵产物不易分离、且只能以附加值较高的甘油为底物，因此在经济上还无法与化学合成法竞争。而以廉价底物(如玉米淀粉水解液)为碳源，用基因工程菌一步法生产1，3-丙二醇，在生产成本上只是化学合成法的五分之一。因此，本论文旨在通过对肺炎克雷伯氏杆菌dha调节子中关键酶基因的克隆、序列分析和串联表达的研究，实现甘油转化1，3-丙二醇基因工程菌的构建。以期为构建以葡萄糖为底物，一步发酵法生产1，3-丙二醇的基因工程菌奠定理论和技术基础。
本文以肺炎克雷伯氏杆菌基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增了dha调节子中的gldABC、dhaT、dhaKL、dhaD四个酶基因。在此基础上，成功地构建了pMD19-TSimple/gldABC、pMD19-TSimple/dhaT、pMD19-TSimple/dhaKL、pMD19-TSimple/dhaD克隆载体；pET-28a(+)/gldABC-dhaT、pET-28a(+)/dhaKL-dhaD、pCDFDuet-1/gldABC-dhaT-dhaKL-dhaD串联表达载体；以及pET-28a(+)/gldABC-dhaT和pCDFDuet-1/dhaKL-dhaD、pET-28a(+)/dhaKL-dhaD和pCDFDuet-1/gldABC-dhaT共表达载体。通过对gldABC、dhaT、dhaKL和dhaD基因测序、序列分析及表达研究得出了以下结论：
甘油脱水酶基因(gldABC)全长2700bp，包括三个开放阅读框架(ORF1、ORF2、ORF3)。ORF1全长为1668个碱基，是以ATG起始密码子开始，UAA终止密码子结束，编码由555个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为60.660KDa；ORF2全长585个碱基，是以GTG起始密码子开始，TAA终止密码子结束，编码由194个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为21.355KDa；ORF3全长为426个碱基，是以ATG起始密码子开始，TAA终止密码子结束，编码由141个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为16.104KDa。通过BLAST同源性分析，该基因与GenBank中已发表的gldABC基因(U60992)的核苷酸序列同源性为99.39％。氨基酸序列的同源性为100％
1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)基因的全长为1164个碱基组成，是以ATG起始密码子开始，UGA终止密码子结束，编码由387个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为41.520KDa。通过BLAST同源性分析，与GenBank上已发表的KPU30903的核苷酸序列的同源性达99.48％，氨基酸序列的同源性为100％。
甘油脱氢酶(dhaD)基因的全长为1104个碱基组成，是以ATG起始密码子开始，UAA终止密码子结束，编码由367个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为40.370KDa。通过BLAST同源性分析，与GenBank上已发表的AL627279.1的核苷酸序列的同源性达83％，氨基酸序列的同源性为91％。
二羟丙酮激酶基因由两个开放阅读框架组成。dhaK开放阅读框架(ORF1)全长为1017个碱基组成，是以ATG起始密码子开始，TAA终止密码子结束，编码由356个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为39.160KDa。dhaL开放阅读框架(ORF2)全长为633个碱基组成，是以ATG起始密码子开始，TAA终止密码子结束，编码由210个氨基酸残基组成的多肽链，该多肽链的计算分子量为22.632KDa。通过BLAST同源性分析，与GenBank上已发表的U00096.2的核苷酸序列的同源性达99％，氨基酸序列的同源性为99.7％。
37℃、1mmol/LIPTG(终浓度)诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT2h。SDS-PAGE电泳结果表明分别在约61KDa、42KDa、21KDa、16KDa的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶23.7U/ml，1，3-丙二醇氧化还原酶30.4U/ml。
37℃、1mmol/LIPTG(终浓度)诱导重组大肠杆菌E.coli/pET-28a(+)/dhaKL-dhaD2h。SDS-PAGE电泳结果表明分别在40KDa、39KDa、23KDa的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱氢酶26.3U/ml，二羟丙酮激酶31.0U/ml。
37℃、1mmol/LIPTG(终浓度)诱导E.coli/pCDFDuet-1/gldABC-dhaT-dhaKL-dhaD重组大肠杆菌3h。SDS-PAGE电泳结果表明分别在约为61KDa、42KDa、40KDa、39KDa、23KDa、21KDa、16KDa的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶14.4U/ml、1，3-丙二醇氧化还原酶20.1U/ml、甘油脱氢酶19.5U/ml、二羟丙酮激酶22.8U/ml。
37℃、1mmol/LIPTG诱导E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT/pCDFDuet-1/dhaKL-dhaD重组大肠杆菌3h。SDS-PAGE电泳结果表明分别在约为61KDa、42KDa、40KDa、39KDa、23KDa、21KDa、16KDa的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶17.5U/ml、1，3-丙二醇氧化还原酶24.5U/ml、甘油脱氢酶21.2U/ml、二羟丙酮激酶22.3U/ml。
37℃、1mmol/IPTG诱导E.coli/pET-28a(+)/dhaKL-dhaD/pCDFDuet-1/gldABC-dhaT重组大肠杆菌3h。SDS-PAGE电泳结果表明分别在约为61KDa、42KDa、40KDa、39KDa、23KDa、21KDa、16KDa的位置上出现了特异性条带。上清液中酶活性分别为甘油脱水酶16.4U/ml、1，3-丙二醇氧化还原酶25.0U/ml、甘油脱氢酶23.2U/ml、二羟丙酮激酶25.6U/ml。
总之，肺炎克雷伯氏杆菌dha调节子中的甘油脱水酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、二羟丙酮激酶、甘油脱氢酶四个关键酶基因在原核表达系统大肠杆菌中实现了高效串联表达及共表达。从而为构建由葡萄糖直接生产1，3-丙二醇的基因工程菌奠定了坚实的理论基础和技术基础。