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内嗅皮层(entorhinal cortex,EC)被认为是海马与其它皮层之间纤维联系的门户,其浅层的主要神经元--星形神经元和锥体神经元接受皮层的纤维投射并通过不同的路径向海马传递信息,Ⅱ层星形神经元的轴突形成穿通路支配海马齿状回和CA3区,而Ⅲ层锥体神经元通过TA通路与海马CA1区和下托的锥体神经元的远端树突形成突触联系。EC不仅在新皮层一海马一新皮层记忆环路中处于重要解剖位置,还与空间学习记忆的形成和巩固密切相关。众所周知,认知功能的完成依赖于良好的觉醒状态。促觉醒肽orexins(又称hypocretins)是由外侧下丘脑区特定神经元亚群分泌的一类小分子神经肽。Orexin系统包括来源于同一前体分子的两个单体orexin-A和orexin-B以及两种特异的G-蛋白偶联受体orexin受体1(orexin receptor1,OX1R)和orexin受体2(orexin receptor2,OX2R)。Orexins在中枢神经系统(central nervous system,CNS)具有广泛的兴奋作用,通过不同的离子信号机制和突触机制调节多个脑区不同类型神经元的兴奋性,进而影响相关脑区功能。腺苷是CNS内的一种能量代谢产物,随着神经元活动的增加而逐渐在脑内积聚。与orexins的作用相反,腺苷在CNS中具有广泛的抑制作用。我们推测正常觉醒状态下EC认知功能的维持和延长觉醒状态下:EC认知功能的下降与EC的orexins和腺苷水平及其对EC神经元兴奋性的调节作用密切相关,但目前尚无文献报道。
本实验采用全细胞脑片膜片钳记录技术,选择ECⅡ-Ⅲ层主要神经元(星形神经元和锥体神经元)为研究对象,首先观察促觉醒肽orexin-A对EC浅层主要神经元的兴奋性调节效应,然后进一步探讨其发挥作用的可能离子通道机制、信号通路机制和突触机制,最后再初步分析稳态因子腺苷对EC浅层主要神经元的兴奋性调节作用。结果如下:
1.Orexin-A通过抑制持续K+通道同时激活非选择性阳离子通道突触后兴奋EC浅层主要神经元
在灌流的ACSF中加入1μMTTX和5 mM的4-AP分别阻断电压门控Na+通道和瞬时K+通道,电压钳模式下,给与细胞跃阶电压刺激(-60 mV～+40 mV,+20 mV,step,0.5 s)分离出持续K+电流,应用orexin-A后记录神经元的持续K+电流明显减小(n=8)。上述结果表明:orexin-A抑制EC浅层主要神经元的持续K+通道提高其兴奋性。
在灌流的ACSF中加入1μM TTX阻断电压门控Na+通道,电压钳模式下,先将记录神经元钳制在-100 mV,持续0.5 s,再给与记录神经元慢电压ramp刺激[-100 mV～0 mV(10 s)],应用100 nM orexin-A后诱发出差异电流(n=6)。Orexin-A诱发电流的平均值在检测电压范围内成一条直线(r2=0.99),表明通道的激活不是电压依赖的,并且其平均反转电位为-41.8±4.8 mV,这正符合非选择性阳离子电流激活的特点。结果提示:orexin-A激活EC浅层主要神经元的非选择性阳离子通道。
另外,我们还检测了orexin-A对超极化激活的阳离子通道、G-蛋白偶联内向整流K+通道、电压门控Ca2+通道和生电性Na+/Ca2+交换泵的影响,均为阴性结果。
2.Orexin-A激活OX1Rs通过PKC信号通路发挥突触后兴奋效应
灌流ACSF中加入5μM SB-334867阻断OX1Rs,在电流钳模式下,给与100 nMorexin-A1～2 min,orexin-A诱发神经元膜电位去极化的作用消失。结果表明,在ECorexin-A的兴奋效应是通过OX1Rs来发挥的。
将脑片在含1μM BIS-Ⅱ的ACSF中至少孵育2 h,并对BIS-Ⅱ采取长时间循环灌流给药。结果显示:在BIS-Ⅱ存在的情况下,orexin-A去极化神经元的作用消失,并且orexin-A抑制持续K+电流(n=8)和激活非选择性阳离子电流(n=9)的效应也消失。结果表明:PKC信号通路参与了orexin-A兴奋EC浅层主要神经元的作用。
3.Orexin-A通过OX1Rs增强EC浅层兴奋性和抑制性突触传递
在灌流ACSF中分别加入10μM荷包牡丹碱阻断离子通道型GABAA受体,或者10μM CNQX和50μM AP-V阻断离子通道型谷氨酸受体,在电压钳模式下,将记录神经元钳制在-60 mV分离出sEPSCs和sIPSCs,100 nM orexin-A明显增加sEPSCs频率(对照的202±56％;n=29;P＜0.001;K-S检验)和幅度(对照的138±29％;n=29;P＜0.001;K-S检验),也能增加sIPSCs的频率(对照的199±45％;n=22;P＜0.001;K-S检验)和幅度(对照的114±11％;n=22;P＜0.001;K-S检验)。上述结果说明,orexin-A可同时增强EC浅层兴奋性和抑制性突触传递。
在上述实验条件的基础上,在灌流的ACSF中加入1μM TTX阻断电压门控Na+通道,将记录神经元钳制在-60 mV分离出mEPSCs和mIPSCs,100 nM orexin-A明显增加mEPSCs频率(p＜0.001,n=6,K-S检验)和幅度(p＜0.001,n=6,K-S检验),也能增加mIPSCs的频率(p＜0.001,n=5,K-S检验)和幅度(p＜0.001,n=5,K-S检验)。上述结果表明:orexin-A既通过突触前效应又通过突触后效应影响突触传递。
灌流ACSF中加入5μM SB-334867阻断OXR1s,100 nM orexin-A增加mEPSCs和mIPSCs的频率(mEPSCs:P=0.17,n=6,K-S检验;mIPSCs:P=0.14,n=5,K-S检验)和幅度(mEPSCs-P=0.22,n=6,K-S检验;mIPSCs:P=0.10,n=5,K-S检验)的效应消失,结果提示OX1Rs介导orexin-A增强突触传递的效应。
4.Orexin-A诱发突触后NMDA受体上调
本实验采用无Mg2+ACSF,在电压钳模式下,将记录细胞钳制在,60 mV。选用NMDA受体选择性激动剂NMDA(100μM)作用于EC浅层主要神经元可诱发出内向电流,电流幅值平均为824.9±163.7 pA(n=7)。此电流可完全被不可逆NMDA受体特异性拮抗剂MK-801(10μM)所阻断。然后通过灌流方式给与100 nM orexin-A15～30min,在这期间浴槽中的MK-801被置换掉,再次应用100μM NMDA后又可诱发出NMDA受体介导的内向电流(41.5±26.3 pA,n=7)。上述结果提示:orexin-A能够使胞浆内的NMDA受体转移到胞膜上。
5.腺苷激活腺苷A1受体降低EC浅层主要神经元兴奋性
在电压钳模式下,通过将神经元钳制在-40 mV水平来诱发其放电,给与100μM腺苷后放电频率逐渐减慢直至放电停止,冲洗后可恢复(n=31)。另外,在静息电位水平下,腺苷使固定电流强度刺激下动作电位发放数目显著减少(加药前:5.5±1.4个;腺苷:2.4±1.3个;冲洗后:5.2±1.3个;n=16;P＜0.001)。接下来,在电流钳模式下,腺苷能够诱发神经元膜电位超极化,并且超极化幅度具有剂量依赖性的特点,50、100和200μM腺苷引起的平均超极化幅度分别为1.5±0.3(n=6)、2.8±0.5(n=20)、4.4±0.6 mV(n=12)。腺苷A1受体拮抗剂DPCPX(3μM)能够阻断腺苷的抑制效应,腺苷A2受体拮抗剂DMPX(10μM)却不能。另外,HCN通道激活剂8-Br-cAMP减弱腺苷的超极化效应,HCN通道阻断剂ZD-7288阻断腺苷的超极化效应。上述结果表明:腺苷激活腺苷A1受体通过关闭HCN通道降低EC浅层主要神经元兴奋性。
综上所述,本实验研究结果表明:第一,orexin-A作用于突触后OX1Rs激活PKC信号通路通过抑制持续K+通道同时激活NSCC提高EC浅层主要神经元兴奋性;第二,orexin-A通过激活OX1Rs增强EC浅层兴奋性和抑制性突触传递;第三,orexin-A还可通过上调突触后NMDA受体长时改变突触可塑性;第四,腺苷激活突触后腺苷A1受体通过关闭HCN通道降低EC浅层主要神经元兴奋性。