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在治疗凝血功能障碍时,如何维持出血和凝血之间的平衡是一个重大挑战。动静脉血栓阻塞性疾病是造成心肌梗塞和脑血管意外的主要诱因。针对这些疾病,溶栓治疗是公认的方法之一。目前临床上所有的溶栓药物都为纤溶酶原激活剂,前提是需要有纤溶酶原的参与。虽然效果显著,但是所有的纤溶酶原激活剂都伴随着出血综合症的风险,尤其是颅内出血,目前没有好的办法避免这一副作用。人们一直试图寻找一些具有更低出血风险且溶栓效果更好的药物。纤溶酶是一种“直接作用”的溶栓药物,相对纤溶酶原激活剂来说,它具有更好的溶栓效果和安全性。虽然无需纤溶酶原的参与,纤溶酶能够直接水解纤维蛋白,但是通过静脉给药后,纤溶酶能够快速的被血液中的抗纤溶酶失活。
在东亚许多国家,地鳖虫一直被用于溶栓治疗,在中国许多地方,人们将地鳖虫作为一种药用昆虫进行人工饲养。为了鉴定其中的溶栓组分,发掘一些新颖的潜在药用分子,我们对地鳖虫的溶栓分子进行了初步研究。
我们从地鳖虫的中肠部分纯化出一个由226个氨基酸残基组成的溶栓蛋白eupolytin1(GenBank accession Gu187070),BLAST比对表明它是一个新颖的丝氨酸蛋白酶。Eupolytin1能够水解纤溶酶的特异底物T6140和胰酶的底物B3133,表明其具有纤溶酶样活性和胰酶样活性。与纤溶酶一样,eupolytin1能够水解纤维蛋白和纤维蛋白原。1μg eupolytin1在1.5 h内就能够完全水解20μg纤维蛋白酶原,与已知的只能部分水解纤维蛋白酶原的α-和(或)β-链的纤溶水解酶不同,eupolytin1能够完全水解纤维蛋白酶原的α-,β-和γ-链。除了能够“直接的”水解纤维蛋白和纤维蛋白原以外,eupolytin1还能够激活纤溶酶原“间接的”水解纤维蛋白。这两种协同作用显然能够提升eupolytin1的纤溶水解效率,相对目前已知的抗栓药物,这样的双功能抗栓蛋白具有更多的内在优势。
根据eupolytin1独特的双功能性质,我们推测它在体内和体外都具有抗栓活性。体外溶栓实验表明,与血浆混合的eupolytin1水解8 mg血凝块所需的时间(1.5 h)远远比单独使用eupolytin1所需的时间更短(18 h)。该结果表明eupolytin1可能能够激活血浆中的纤溶酶原从而促进血凝块溶解。
体内大鼠动静脉旁路血栓形成实验和角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓形成实验进一步表明,eupolytin1具有极强的溶栓活性,比对照尿激酶效果还要好。在体内大鼠动静脉旁路血栓形成实验中,eupolytin1和尿激酶的溶栓能力都呈剂量依赖关系,浓度为0.06μM/kg体重的eupolytin1能够使3.7±0.3 mg的血栓重量减至1±0.2 mg,而相同浓度的尿激酶只能使血栓重量减至1.7±0.3 mg;在角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓实验中,eupolytin1和尿激酶的溶栓能力也呈剂量依赖关系,浓度超过0.04μM/kg体重的eupolytin1处理48小时后能完全清除角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓。
在兔体内的出血风险评估实验表明,相对尿激酶而言,eupolytinl在高剂量(0.12μM/kg体重)时才有少量出血,该剂量为角叉菜胶诱导的小鼠尾静脉血栓形成实验中完全清除血栓所需剂量的3倍。为了揭示eupolytinl的低出血风险原因,我们检测了兔血浆中纤维蛋白原的浓度改变。使用eupolytinl样品(0.08μM/kg体重)8 h后,纤维蛋白酶原的浓度达到最低,14 h后浓度恢复到正常水平。Eupolytin1在体内独特的动力学特性不但增加了纤溶效率,同时也降低了出血风险。另外,在只含有微量纤溶酶原的脑髓液中,eupolytin1有可能能够作为“直接作用”的溶栓剂使用。
根据测定的氨基酸序列,从地鳖虫中肠扩增蛋白eupolytin1的编码基因时,我们发现该蛋白的编码基因表现出丰富的多样性。我们共扩增了21条eupolytin1相关的编码基因,GenBank accession Gu187070-Gu18707090。
我们下一步的工作需要研究该溶栓分子的结构和功能关系并评估其作为安全的临床纤溶药物的可行性。