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肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, Spn)和不可分型流感嗜血杆菌(nontypcable Haemophilus influenzae, NTHi)是成人下呼吸道感染(包括社区获得性肺炎和慢性阻塞性肺病急性发作)中最常见和最重要的病原体。Spn和NTHi的发病复杂，疾病的转归涉及细菌毒力因子和宿主免疫反应的平衡。各种宿主细胞、受体和信号传导通路在宿主抵抗Spn和NTHi的过程中起到重要作用。然而呼吸道上皮细胞、肺泡巨噬细胞在上述细菌所致肺部炎症反应中的作用以及它们与细菌相互作用的分子机制并未得到充分阐明。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是近年发现的一个受体家族。TLR通过病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)广泛且特异性地识别各种病原微生物，激活人体天然免疫，在感染早期发挥重要作用。在TLR受体家族中，TLR2，4与细菌发病的关系较为密切。TLR下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)通路是调控真核细胞反应的重要信号系统，参与了细胞对外界刺激的多种反应，包括细胞生长、死亡、细胞周期、炎症和应激反应等。我们目前所掌握的关于上述病原菌发病和肺部宿主免疫反应的资料大多来自于动物模型，体外细胞模型研究以及临床标本的横断面剖析，而对于病原菌在人肺脏组织如何与宿主细胞相互作用以及动态转归，我们所知甚少。考虑到急性肺炎患者的肺组织标本很难获取，我们从胸科手术的肺组织标本中获取正常的肺组织，建立Spn和NTHi的肺组织体外急性感染模型(Acute lung infection model,ALIM)，作为连接细胞和整体动物模型的桥梁，在组织水平研究肺部疾病的病理生理变化。利用该模型进行组织、分子病理学研究以及功能研究可以展示肺部感染性疾病发生发展的连续横断而(snapshot)。另外，ALIM模型与COPD慢性持续性病原感染者的肺组织标本相比较，将有助于我们阐明细菌定植和肺部慢性炎症持续存在的可能机制。耐药菌株的涌现和疫苗预防效果的局限性使得Spn和NTHi发病机制的深入研究迫在眉睫。阐明Spn和NTHi感染的细胞和分子发病机制(如关键的受体和信号传导通路)将为呼吸道细菌感染性疾病的预防和控制开辟新的思路，提供新的干预靶标。第一部分：人肺组织体外急性感染模型的建立建立Spn和NTHi的人肺组织体外急性感染模型(ALIM)：从胸科手术标本中切取距肿块或结节5cm外的正常肺组织，肺组织块(1cm~3)与不同浓度的Spn和NTHi共孵育4h，24h，48h后，收集上清，并取组织块置于羟乙基哌嗪乙磺酸-谷氨酸介导的具有保护作用的有机溶剂(HOPE)中固定。组织上清乳酸脱氢酶(LDH)结果提示：Spn和NTHi肺组织感染模型可在体外存活48h以上。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清白介素(IL)-8显示：Spn和NTHi以细菌浓度依赖的方式诱导ALIM炎症反应。经HOPE溶液处理的肺组织，抽提的RNA完整，无明显降解，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)显示：ALIM中IL-8 mRNA的表达较未予细菌刺激组明显增高。Immunoblot法可检测到ALIM组织中β-actin蛋白的表达。这提示：HOPE溶液对肺组织的核酸和蛋白质有着良好的保护作用。ALIM，作为连接人体细胞和整体动物模型的桥梁，使我们可以在组织水平研究肺部感染性疾病发生发展的连续横断面变化。ALIM和HOPE固定技术的结合为肺部疾病的细胞和分子发病机制研究提供了一个新的功能研究平台。结论：1．初步建立了Spn和NTHi的人肺组织体外急性感染模型。2．HOPE-solution对肺组织核酸和蛋白质有很好的保护作用，可用于组织形态学和分子病理学的研究。第二部分：肺炎链球菌致人肺组织炎症反应的细胞和分子机制研究利用人肺组织体外急性Spn感染模型(ASIM)和体外细胞培养研究Spn诱导肺组织炎症反应的细胞和分子机制。原位杂交(ISH)结果显示：Spn感染离体肺组织24-48h后，在80-90％的肺泡巨噬细胞和15-30％的Ⅱ型肺泡上皮细胞内可检测到Spn-DNA，而支气管上皮细胞Spn的感染率极低(＜1％)。用抗生素杀死胞外细菌，取组织匀浆涂抹羊血琼脂培养板过夜后，可见Spn生长。免疫组化(IHC)结果显示：与对照组比较，氯膦酸盐／脂质体(Clodronate／liposomes)作用24h后，肺组织中CD68~+肺泡巨噬细胞的数目无明显减少，但是巨噬细胞中的凋亡蛋白Caspase-3的表达却明显增强。同时Spn刺激后，Clodronate／liposomes处理组上清中的肿瘤坏死因子(TNF)-α较对照组显著降低。这提示Clodronate／liposomes可以通过诱导肺组织中巨噬细胞的凋亡来下调Spn诱导的炎症反应，肺泡巨噬细胞在Spn所致人肺组织的炎症反应中具有重要作用。定量RT-PCR检测发现：Spn刺激24h后，ASIM中TLR-2，4mRNA的表达较未感染的肺组织明显增高。IHC和Immunoblot均证实：ASIM和细胞感染模型中磷酸化的p38MAPK和ERK MAPK不同程度地表达上调。分别应用功能性TLR-2，4单克隆抗体和p38，ERK MAPK抑制剂阻断受体和信号通路，观察它们对Spn诱导的肺组织和细胞炎症反应的影响。ELISA结果显示：与阻断TLR2，4受体和ERKMAPK通路相比，抑制p38 MAPK信号通路可以显著降低ASIM上清中IL-8，IL-6，TNF-α的水平。利用肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549，我们证实p38MAPK是介导Spn所致肺部炎症反应的重要信号分子。结论：1．Spn可能是兼性的胞内菌，肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞可能是Spn在肺部主要的宿主细胞。2．建立了肺泡巨噬细胞失活的体外肺组织模型，该模型可用于研究肺泡巨噬细胞在各种环境因素诱导的肺部免疫反应中的作用。3．肺泡巨噬细胞在Spn诱导的肺组织急性炎症反应中具有重要地位。4．Clodronate／liposomes可能通过Caspase-3途径诱导肺组织肺泡巨噬细胞的凋亡。进而下调炎症反应。5．P38 MAPK是介导Spn所诱导的肺组织炎症反应的关键信号分子。第三部分：不可分型流感嗜血杆菌致人肺组织炎症反应的细胞和分子机制研究利用人肺组织体外急性NTHi感染模型(AHIM)和体外细胞培养研究NTHi诱导肺组织炎症反应的细胞和分子机制。ISH结果显示：NTHi刺激离体肺组织24h后，在70-85％的肺泡巨噬细胞和15-30％的Ⅱ型肺泡上皮细胞内可检测到NTHi-DNA。PCR结果显示COPD患者肺组织中NTHi感染率达35.7％(15／42)，ISH法证实肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞NTHi的感染率分别为：40-50％和35-45％。NTHi在肺组织急、慢性感染中靶细胞不同的感染率提示：肺泡上皮细胞可能是NTHi在肺组织长期定植较为合适的宿主细胞。IHC和Immunoblot结果显示：AHIM和A549细胞感染模型中磷酸化的p38 MAPK和ERK MAPK不同程度地表达上调。电泳迁移率检测(EMSA)和流式细胞术(FCM)结果显示：NTHi刺激后，肺组织和A549细胞内核因子NF-κB活性明显增强，并且抑制p38MAPK通路并不影响细胞核内NF-κB的DNA结合活性。分别用p38 MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂PDTC预先阻断相关分子，可以显著降低感染NTHi的A549细胞分泌IL-8因子：而ERK MAPK剂UO126并不能阻断IL-8因子的分泌。因此，NTHi是通过NF-κB和p38 MAPK依赖的途径诱导A549细胞生成IL-8。结论：1．NTHi可能是兼性的胞内菌。肺泡巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞可能是NTHi在肺部主要的宿主细胞。2．肺部NTHi急性感染和COPD慢性持续性NTHi感染间可能具有不同的感染模式。在COPD慢性NTHi感染中，肺泡上皮细胞可能是NTHi更为适合的宿主细胞。3．NTHi通过p38 MAPK和NF-κB依赖的方式诱导肺泡上皮细胞分泌炎症介质。