【摘 要】
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糖苷是一类重要的次级代谢天然产物,具有多种药理活性,在医药、食品、保健品领域都有广泛应用。糖苷的生物合成需要两种前体,由于苷元和活性糖供给的限制,单菌合成糖苷的效率
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糖苷是一类重要的次级代谢天然产物,具有多种药理活性,在医药、食品、保健品领域都有广泛应用。糖苷的生物合成需要两种前体,由于苷元和活性糖供给的限制,单菌合成糖苷的效率往往很低。本文以红景天苷和淫羊藿次苷D2为例,采用汇聚线路,由苯丙氨酸缺陷的BMT菌株合成酪醇,酪氨酸缺陷的BMS菌株合成UDP-葡萄糖和糖苷,组成大肠杆菌共培养系统,研究了途径构建和共培养系统的优化控制。我们构建酮基脱羧酶基因kdc4的组成型表达载体,得到菌株BMT21,摇瓶发酵36h,可生产酪醇1.46g/L。在UDP-葡萄糖强化菌株BMS9中,表达拟南芥来源的密码优化的糖基转移酶基因synugt85a1,得到菌株BMS23,摇瓶发酵36h,可将500mg/L酪醇几乎全部转化,生成927.04mg/L红景天苷。BMT21与BMS23共培养后,无需添加苯丙氨酸和酪氨酸,在极限培养基上能形成稳定良好的互养生长关系。为了解除共培养系统中两个菌株对碳源的竞争,在敲除ptsG基因的基础上,敲除manZ基因,构建了优先利用木糖的菌株BMT23;敲除xylA基因,构建了只能利用葡萄糖的菌株BMS24。研究了葡萄糖木糖比例、接种比例对共培养系统和糖苷合成的影响,优化了发酵控制。在最适条件下,共培养系统摇瓶发酵36h可合成红景天苷670.58mg/L,只有少量酪醇积累。在5L发酵罐中补料发酵129h,红景天苷产量达6.03g/L,没有中间产物积累。为了验证共培养系统的灵活性,选用非特异性的糖基转移酶YjiC,同时生产红景天苷和淫羊藿次苷D2。经过对碳源、接种比例等发酵条件优化,在最适条件下摇瓶发酵48h,可生产403.45mg/L红景天苷,409.34mg/L淫羊藿次苷D2。在5L发酵罐中补料发酵84h,红景天苷产量为2.27g/L,淫羊藿次苷D2产量分为2.38g/L。将苷元和活性糖由两种菌株分别合成,组成共培养系统,是一种非常有潜力的生产糖苷策略,而且对其他复杂天然产物的高效合成也有借鉴价值。
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