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目的:
建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察二氮嗪后处理对缺血再灌注损伤大鼠心脏功能的影响,以及二氮嗪后处理对线粒体内蛋白质表达的影响。
方法:
建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型。将24只雄性SD大鼠随机分为空白组(Nor)、缺血再灌注损伤组(Con)、二氮嗪后处理组(DZ)、5-羟葵酸拮抗二氮嗪后处理组(5HD-DZ),每组6只。
各组灌注方案:
Nor组:持续灌注K-H液120min,无缺血再灌注损伤。Con组、DZ组、5HD-DZ组缺血前先灌注Kerbs-Henseleit缓冲液(K-H液)平衡20min,灌注4℃ST.Thomas停跳液,使全心缺血40min后,此三组按以下方案灌注:①Con组:灌注K-H液60min;②DZ组:灌注K-H液前给予50μmol/L二氮嗪5min,继之K-H液55min;③5HD-DZ组:序贯灌注100μmol/L5-羟葵酸5min、50μmol/L二氮嗪5min、K-H液50min.
观察各组平衡末及灌注末心功能,于灌注末取左心室组织,采用差速离心法和Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠心肌线粒体.采用2D-DIGE和MALDI-TOF-MS技术,检测鉴定各组心肌线粒体的蛋白质表达情况,蛋白表达的差异在1.5倍以上者为有意义。
结果:
(1)利用Nycodenz密度梯度离心法提纯的线粒体纯度高;
(2)再灌注前给予二氮嗪处理(DZ组)的缺血心脏,心功能明显好于Con组和5HD-DZ组(P＜0.05),Nor组心功能优于DZ组(P＜0.05);
(3)经2D-DIGE和MALDI-TOF-MS鉴定,与Nor组比较,Con组、DZ组、5HD-DZ组丙酮酸脱氢酶E1α亚基(PDHAD、短链/支链脂酰辅酶A脱氢酶(ACADSB)、NADH脱氢酶I10α亚基(NDUFA10)和rCG55630四个蛋白在缺血再灌注末的表达量增加;
(4)再灌注末,DZ组NDUFA10和rCG55630的升高程度低于Con组和5HD-DZ组;再灌注末,PDHA1和ACADSB在Con组,DZ组和5HD-DZ组中的表达无明显差异.
结论:
(1)PDHA1、ACADSB、NDUFA10和rCG55630在缺血/再灌注早期表达上调;
(2)二氮嗪后处理可抑制心肌缺血/再灌注早期NDUFA10和rCG55630表达的增加;
(3)二氮嗪后处理能够减轻心肌缺血/再灌注损伤,有保护心肌,改善心功能的作用;
(4)用不连续密度梯度离心法可提取到高纯度的线粒体。