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近年来,猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)在国内许多Bartha-K61疫苗免疫的猪场大规模爆发,相关研究表明,引起该病大规模爆发的病原为发生变异的猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),多数猪场的PRV野毒感染普遍存在。该病传播迅速,严重危害我国养猪业的发展,引起人们的广泛关注。本研究对从吉林省某疑似PR发病猪场采集的病料进行病毒分离鉴定,分离出一株PRV JL1株,对该毒株的主要基因进行遗传变异分析,以进一步了解PRV遗传变异情况。同时,以分离的JL1株为亲本株,构建gE基因缺失转移载体,以期为后续构建PRV gE基因缺失株打下基础。研究内容分为以下3部分:1.PRV流行变异株JL1株的分离鉴定采集吉林省某疑似猪伪狂犬病发病猪场的组织样品,经研磨处理后,将采集的病料接种于ST细胞进行病毒分离,24h后在接种脾脏上清的细胞中可见细胞聚集、融合等细胞病变。PCR检测和序列测定结果表明,分离的病毒为猪伪狂犬病毒,命名为JL1株。动物回归试验结果表明,该分离毒株对2月龄仔猪具有较强的致病性。2.PRV流行变异株JL1株主要基因的遗传变异分析设计合成特异性引物,对PRV JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因进行克隆测序,并与GenBank上发表的国内外毒株基因序列进行比较和遗传进化分析。PRV JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因与国内外其他参考毒株的核苷酸同源性为99.4%~100%,95.5%~99.9%,98.3%~99.9%,97.6%~99.9%和98.1%~99.9%;氨基酸同源性为98.8%~99.7%,92.4%~99.5%,96.5%~99.5%,95.5%~99.5%和96.4%~99.6%。各基因核苷酸和氨基酸同源性分析结果表明,JL1株与我国新分离的流行变异株同源性较高,而与国外经典毒株同源性较低。氨基酸多序列分析结果显示,PRV JL1株gE基因第48位和496位各插入一个天冬氨酸(D),与新流行变异株的基因特征一致。同时gD基因、gI基因和gB基因分别有不同数量的氨基酸的插入和缺失。结果表明,JL1株的缺失变异情况与国内新流行变异株如JS-2012株相同。遗传进化分析结果表明,PRV JL1株与国内近年来分离的流行变异毒株亲缘关系较近,而与国内外分离的经典毒株亲缘关系较远。以上结果均表明,PRV JL1株属于国内近几年分离的新流行变异毒株。3.PRV流行变异株JL1株gE基因缺失转移载体的构建通过对gE基因同源臂gEL和gER以及EGFP基因进行扩增,酶切,连接和克隆等方法,将gEL,EGFP和gER连接到pBluescript IISK表达载体上,构建PRV gE基因缺失转移载体pSK-gELR-EGFP。经酶切和测序结果鉴定,该转移载体构建成功。此外,采用FuGENE~?HD转染试剂,将构建好的转移载体转染于PK-15细胞,通过倒置荧光显微镜可在转染细胞中观察到绿色荧光。以上结果表明,构建并获得了gE基因缺失转移载体,并且该转移载体能够在PK-15细胞内表达。本研究从分离的PRV流行变异株JL1株的遗传进化和分子特征分析可知,该毒株为PRV流行变异毒株,与国外毒株尤以Bartha毒株存在较大的遗传差异,为进一步解释中国Bartha疫苗免疫猪场再次突发PR的原因提供理论依据;同时,成功构建带有筛选标记EGFP的gE基因缺失转移载体,为gE基因缺失疫苗株的构建和新型疫苗的研制奠定基础。