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由结核分枝杆菌(Mtb)感染所导致的结核病(TB)仍然是一个重要的全球性的健康威胁。据世界卫生组织报告称，在2013年约有900万人感染结核杆菌，并且有150万人死于结核病。而且，多耐药结核和泛耐药结核的出现、结核菌与艾滋病毒的共感染以及卡介苗的低效率等一系列问题进一步困扰了结核杆菌的预防和治疗。所以，新的抗结核药物的研发变得尤其重要。本论文包含两方面的研究内容:首先，对结核菌的DNA聚合酶Ⅲ进行了生化功能研究，另外，对分枝杆菌细胞壁关键组分分枝菌酸合成途径的重要酶FadD32进行了结构生物学研究。 由于结核杆菌的基因组复制是由DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)完成的，所以其对结核杆菌的存活和增殖具有重要意义。Mtb DNA polⅢ也因此被认为是抗结核药物开发的重要靶点，但是关于其活性机理的研究却并不多。E.coliDNA聚合酶Ⅲ全酶是一个至少由10种亚基组成的生物大分子机器:α、ε、θ、β、(τ)/γ、δ、δ、x和ψ。所有的亚基组装成三个功能单位，分别是聚合酶核心（αεθ core）、滑动钳（β clamp）和滑动钳装载复合物(clamp loader)。由α亚基作为主要的DNA合成催化亚基。但是在Mtb中，并没有发现相应的θ、x和ψ亚基。 本研究中，我们在E.coli中克隆、表达和纯化了Mtb DNA polⅢ的全部亚基，并用这些亚基在体外重建了由全酶催化的DNA前导链的复制过程。我们研究发现，Mtbα亚基只有和ε亚基、β clamp以及clamp loader在一起形成全酶以后才会变成一个高效率的DNA复制酶，并且单链结合蛋白(SSB)可以明显提高DNA的复制效率。我们对Mtb DNA polⅢ全酶的体外组装以及由其催化的DNA前导链复制体系的重建为研究Mtb DNA polⅢ的复制机理奠定了基础，同时也为针对Mtb DNA polⅢ全酶的抗结核药物的筛选构建了良好的平台。 由于Mtb中没有DNA错配修复相关的蛋白，所以DNA polⅢ的复制保真性对于维持基因组稳定性和阻止耐药菌的产生具有重要意义。E.coli DNA polⅢ的校读亚基是一个单独的ε核酸外切酶亚基，但是，T.thermophilus DNA polⅢ的校读活性是由其α亚基的PHP结构域来负责的。之前的研究证明，在部分细菌中两种校读活性不能在同一中细菌中共存。但是，我们的研究发现，MtbDNA polⅢ的ε亚基和α亚基都具有3-5的单链DNA倾向性的核酸外切酶活性，并可能都在DNA复制过程中发挥校读活性。 我们分别用免疫共沉淀(Co-IP)、表面等离子共振(SPR)、生物膜干涉(BLI)和等温滴定微量热(ITC)等方法研究了Mtbα、ε和β亚基两两之间在体内和体外的物理相互作用，发现Mtbα、ε和β亚基可以形成一个与E.coli类似的α-β2-ε复制酶复合物。但是，与E.coli不同的是，在Mtbα-ββ2-ε复合物中α和ε之间并不存在直接的相互作用，而是通过α-β2和ε-ββ2这两对相互作用将α和ε间接的连接在一起，其中β亚基发挥了重要的桥梁作用。 相应地，我们用生物化学的方法研究了Mtbα、β和ε亚基之间的功能性相互作用，发现β和ε亚基单独都可以刺激α亚基的DNA聚合酶活性，而且β亚基的刺激作用要比ε亚基强。在DNA复制过程中，β clamp的出现能明显地提高α-ββ2-ε复制酶的DNA聚合活性，并且抑制其核酸外切酶活性。这种现象明显依赖于α亚基活性中心对DNA的持续复制反应。这说明，β clamp的出现以及适合DNA复制的条件的满足在Mtb DNA polⅢ从校读活性状态到聚合活性状态的转变过程中发挥重要作用。我们的研究对于探索Mtb DNA polⅢ在聚合和校读两种活性之间的转变机理提供了新的视角。 FadD32是分枝菌酸生物合成途径中的一个关键的酶，对于分枝杆菌的生长和繁殖非常重要，是最近被发现的一个有效的并且有潜力的抗结核药物研发靶标。在本研究中，我们报告了耻垢分枝杆菌FadD32蛋白在apo状态和ATP结合状态的晶体结构，分辨率分别为2.4(A)和2.25(A)。FadD32蛋白由两个球形结构域组成，两个结构域间靠一个柔性linker相连。ATP分子结合在N端和C端结构域界面间的一个裂缝中，ATP的结合可以诱导FadD32蛋白产生重要的本地构象变化。通过与腺苷化酶ANL超家族的其他成员进行比对发现了FadD32与meromycolic acid和phosphopantetheine结合的位点。我们的研究增进了我们对FadD32催化机理的认识，对于以FadD32为靶标设计更有效的抑制剂分子奠定了结构基础。