中医脾虚证与线粒体能量代谢的分子生物学研究

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wintelchia
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目的:  通过研究分析脾气虚证和脾不统血证大鼠骨骼肌、心肌线粒体能量代谢,探讨中医脾虚证候与线粒体功能的关系;并阐明脾气虚证与脾不统血证大鼠两种证候的实质及其线粒体能量代谢差异的机理。  方法:  1.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠模型的构建  将SPF级SD雄性大鼠随机分为四组,正常对照组,低分子肝素钠对照组,脾气虚组和脾不统血组。采用游泳疲劳加饮食失节法处理脾气虚组和脾不统血组大鼠,构建脾气虚证大鼠模型。成功后,在维持上述处理因素的基础上,对脾不统血组大鼠皮下注射低分子肝素钠处理,构建脾不统血证大鼠模型。记录大鼠体征和行为变化,并检测其生理代谢变化。  2.测定实验大鼠组织ATP含量,分析脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠骨骼肌、心肌能量代谢情况。  3.检测实验大鼠骨骼肌、心肌组织线粒体呼吸链复合物(ComplexⅠ、ComplexⅡ、ComplexⅢ、ComplexⅣ)的活性。  4.检测实验大鼠骨骼肌、心肌组织线粒体柠檬酸合酶(CS)的活性。  5.测定实验大鼠线粒体DNA拷贝数,分析脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠骨骼肌、心肌线粒体变化。  6.提取实验大鼠骨骼肌、心肌组织总蛋白,采用蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测COXIV蛋白和Cyt-C蛋白表达量的变化。  7.采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测实验大鼠骨骼肌、心肌组织中COXIV蛋白和Cyt-C蛋白的mRNA表达量变化。  结果:  1.造模处理42天后,成功构建脾气虚证大鼠模型,75天后,成功构建脾不统血证大鼠模型,为研究脾虚证和线粒体的关系立下基础。  2.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的骨骼肌ATP含量较正常大鼠均显著性降低,并且二者之间有统计学差异。末期脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的心肌 ATP含量较正常大鼠均显著性降低,但二者之间没有统计学差异。  3.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠骨骼肌线粒体呼吸链复合物活性较正常大鼠均显著降低,且二者之间有统计学差异。末期脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠心肌线粒体呼吸链复合物活性较正常大鼠均显著降低,但二者之间没有统计学差异。  4.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的骨骼肌柠檬酸合酶活性较正常大鼠均显著性降低,且二者之间有统计学差异。脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的心肌柠檬酸合酶活性较正常大鼠均显著性降低,且二者之间有统计学差异。  5.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的骨骼肌线粒体DNA(mtDNA)拷贝数较正常大鼠均显著性降低,但二者之间没有统计学差异。在心肌中,脾不统血证大鼠mtDNA拷贝数较正常大鼠显著性升高,脾气虚组大鼠 mtDNA虽略显升高,但与正常对照组无统计学差异,与脾不统血组大鼠相比也没有显著性差异。  6.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的骨骼肌 COXIV蛋白表达量较正常大鼠均显著降低,Cyt-C蛋白表达量均显著升高,但两组大鼠骨骼肌的这两种蛋白表达量均没有统计学差异。末期脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的心肌COXIV蛋白表达量较正常大鼠均显著性降低,但二者之间没有统计学差异;脾气虚组中期大鼠的心肌Cyt-C蛋白表达量较正常大鼠显著性降低,脾不统血组末期大鼠的心肌Cyt-C蛋白表达量则显著升高。  7.脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的骨骼肌COXIV蛋白的mRNA表达量较正常大鼠均显著性降低,Cyt-C蛋白的mRNA表达量均显著性升高,但两组大鼠这两种蛋白的mRNA表达量均没有统计学差异。脾气虚证大鼠和脾不统血证大鼠的心肌 COXIV蛋白的mRNA表达量较正常大鼠显著性降低,但二者之间没有统计学差异;脾气虚组中期大鼠心肌Cyt-C蛋白的mRNA表达量较正常大鼠显著性降低,脾不统血组末期大鼠心肌Cyt-C蛋白的mRNA表达量则显著性升高。  结论:  1.中医脾虚病证与线粒体能量代谢障碍互为因果关系。  2.脾虚证大鼠线粒体呼吸链复合物活性及柠檬酸合酶活性的降低,是其组织ATP含量降低的重要原因。  3.脾虚证线粒体能量代谢障碍涉及线粒体DNA拷贝数的变化与COXIV蛋白和Cyt-C蛋白及其mRNA表达量的改变。  4.脾虚证大鼠表现出骨骼肌和心肌线粒体能量代谢障碍,符合了中医脾主肌肉的理论。  5.脾不统血证与脾气虚证线粒体能量代谢障碍程度的不同,是两种病证差异的重要机理。
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