接种异养硝化菌Lutimonas sp.H10对生物滤器微生物种群结构的影响及短小芽孢杆菌H2益生菌的筛选

来源 :中国科学院微生物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:CHJ2000
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生物滤器是海水封闭循环水养殖系统的关键水处理单元。本实验构建了两套曝气生物滤池(BAF)用于循环养殖海水中氨氮的去除试验,所用循环水为人工模拟海水养殖废水,系统运行的水力停留时间为1h,水温控制在18~25℃,气水比为3:1,pH为8.05~8.53;其中一套接种异养硝化细菌Lutimonas sp.H10菌株作为生物强化处理系统,另一套为对照处理系统。相关指标分析表明,在生物强化反应器中,氨氮去除率并没有得到改善,相反,在大规模接种后,在运行到第9天至第18天,出现硝化效率下降的情况;而对照反应器硝化效率保持稳定。本文对实验中生物强化效果不佳的原因进行了深入的探讨和分析。首先采用荧光原位杂交(FISH)方法和培养的方法跟踪检测了所接种的菌株变化情况。结果表明,接入的Lutimonas sp.H10在生物强化反应器的5天内几乎完全消失。通过摇瓶实验、噬菌斑检测实验以及电镜分析,证明接入菌株消失的主要原因是由于感染了Lutimonas sp.H10特异性的噬菌体。此外,生物膜形成能力测定实验表明,接入菌株的较弱的生物膜形成能力也是生物强化效果不佳的原因之一。采取构建16S rRNA基因文库的方法对生物滤器挂膜阶段细菌种群结构进行了分析。结果表明,2套生物滤器的细菌种群结构的演化差别非常明显,在对照反应器挂膜初期(第1天)体系中的优势菌为CFB类群,然后是Alpha-proteobacteria,再其次是Planctomycetes。在中期(第20天)、后期(第30天)CFB类群的比例不断下降,而gamma-Proteobacteria在中期成为优势菌群,后期增至50%以上。Alpha-proteobacteria在整个实验中比例保持相对稳定。然而,在生物强化反应器中,初期除了占优势数量的CFB外,a-proteobacterium和Planctomycetes也是主要类群;中后期α-proteobacterium比例增大成为优势类群。在生物强化反应器中还观察到原生动物的过度繁殖。这些结果表明,噬菌体感染和较弱的生物膜形成能力是生物强化效果不佳的主要原因。而原生动物对细菌的捕食可能是生物强化反应器在第9-18天硝化效率崩溃的主要原因。通过对此次生物强化效果不佳原因的详细调查,发现了噬菌体感染和土著微生物的竞争是海水养殖系统中进行生物强化最重要的制约因素,为以后生物强化菌株的筛选提供了理论基础和一些必要的筛选原则。   本论文还考察了不同浓度有机碳源对反应器中异养菌、氨氧化菌和亚硝酸氧化菌生物量的影响。采用四种填料:竹节、陶粒、麦饭石和生物滤球,每组反应器三个平行。在C/N比分别为0,0.8,2,8和12时,测定了反应器中异养菌、氨氧化菌和亚硝酸氧化菌数量的变化。结果表明随着C/N的升高,四种填料的异养菌大幅度增加、而氨氧化菌和亚硝酸氧化菌的数量均有一定程度的下降。   本论文的另一部分工作是对两株分离自海洋沉积物的芽孢杆菌H2和H4菌株进行了弧菌拮抗能力以及对养殖动物的疾病防御能力进行了探讨。菌株H2和H4经生理生化特性、16S rRNA基因序列分析分别鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus H2)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis H4),拮抗试验结果表明,H2和H4菌株均对需钠弧菌的生长有显著的抑制作用;但只有H2菌株在模拟养殖动物小肠环境中生长良好,细胞浓度维持在1010CFU/mL左右,说明该菌株能够抵御养殖动物消化系统的破坏作用。选择其进一步进行模拟试验(20尾虾苗为一组),结果表明对照组(不接种)存活32小时,接种弧菌的实验组仅存活16小时,同时接种H2菌株和弧菌的实验组存活了48小时,接种H2菌株的实验组存活了72小时菌株,说明菌株H2可显著提高凡纳滨对虾的存活时间。在现场实验中,100 L养殖池中(50尾虾/池),分别接种0(对照),103,and104CFU/mL的菌株H2维持14 d,再感染104 CFU/mL需钠弧菌1 d。结果表明:接种104CFU/mL菌株H2的试验组,虾的死亡率仅为12.5%,显著低于对照组的30.8%。结果还表明,接种104 CFU/mL,菌株H2的试验组,虾的体长体重都略高于对照组,但各实验组之间差异均不明显。以上结果说明,芽孢杆菌H2菌株能有效对养殖动物的弧菌疾病进行防治,显著降低养殖动物死亡率,具有一定的应用价值,为将其作为益生菌大规模应用于水产养殖中提供了新的微生物资源和理论基础。
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