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研究背景与目的C-erbB-2(HER-2/neu)为脊椎动物的原癌基因。结构和功能上与EGFR基因相似,是一种受体酪氨酸激酶。其扩增或产物p185蛋白的过度表达则与多种肿瘤密切相关。大量研究表明, C-erbB-2阳性胃癌的转移性和侵袭性均较强,易侵及浆膜层、出现淋巴结转移和腹膜种植。目前普遍认为,C-erbB-2表达是胃癌进展期的中晚期事件,对于胃癌的预后判断具有重要意义。动物研究和蛋白质分析表明位于HER-2蛋白跨膜转导域的Ile655Val多态性,可能会通过改变二聚体化和活化,从而刺激激酶活化和细胞转化。由此推断HER-2基因Ile655Val突变(A→G)可能是一种致癌因素,并可能影响临床结果,预示不良预后。鉴于相当一部分单核苷酸多态性(SNP)的频率在不同民族、人群有显著差异。我国人群中胃癌与C-erbB-2单核苷酸多态性之间的关系尚未见报道。本实验拟通过以我国人群HER-2基因Ile655Val多态性为切入点,探讨其在中国胃癌人群及正常人群中的分布特点及其与胃癌的易感性、临床病理特征等方面的关系。从而对胃癌相应的遗传机理和发病机制作进一步深入的探索。材料与方法1.病人及标本收集:纳入2005年11月至2007年3月间长海医院经手术病理证实为胃癌的患者152例,正常健康志愿者58例。抽取外周静脉血2ml,4℃保存,1周内及时处理。研究对象均获知情同意,研究方案符合1975年赫尔辛基宣言的伦理纲要。2.DNA抽提:采用血液DNA抽提试剂盒(博光生物科技有限公司),按说明书操作,按步骤依次加入相应裂解液,从全血中分离出基因组DNA,并依据实际情况做相应调整。每300μL全血抽提DNA得率约为10μg。3.PCR反应:经过论证,在包含研究位点长度378bp两侧设计引物:Forward:5’-AAGCCTGTGGGTCACCCTTC-3’,Reverse:5’-ATCGCTCCGCTAGGTGTCAG -3’。经条件优化后,选用94℃变性5min,94℃(30s)、62℃(30s)、72℃(40s)、40个循环,72℃延伸12min。4.PCR反应产物纯化:采用吸附柱式PCR产物回收试剂盒(博光生物)去除引物二聚体、缓冲体系、聚合酶、多余的引物及体系中的dNTPs。5.RFLP基因分型:酶切反应体系20μL:10×buffer 2μL,BsmAI限制性内切酶0.5μL,PCR产物17.5μL。55℃水浴2小时。110V电压电泳20min,凝胶成像系统分析记录结果。378bp的目的基因片段经BsmAI限制性内切酶切割后分为3种基因型:纯合切开型G/G(Val/Val),纯合未切开型A/A(Ile/Ile),杂合型A/G(Ile/Val)。6.统计学分析:应用SAS8.2统计软件。Fisher确切概率法、卡方检验、Mantel-Haenszel卡方检验以及Cochran-Mantel-Haenszel法,分别分析HER-2基因型分布在病例与对照组之间差异是否显著,以及性别、年龄、病理分级及分期、HER-2蛋白表达情况、发病风险、以及其他部分相关基因与Ile655Val多态性的关系。P值小于0.05被认为具有统计学意义。实验结果1.胃癌的患者150例,其中男性108例(72.00%),女性42例(28.00%),平均年龄54.72±12.38岁。正常健康志愿者58例,其中男性38例(65.52%),女性20例(34.83%),平均年龄53.45±12.81岁。经检验,选取病例及对照组之间的人口统计学特征无明显差异。2. Val/Val基因型与Ile/Ile相比,发病的风险率显著增加,OR:4.74 (95% CI 0.59-3.82);Ile/Val型次之1.85(0.88-3.92)。等位基因Val在病例组中出现的频率(0.21)显著高于对照组(0.11) ,(Mantel-Haenszel卡方值为4.7293,P=0.0297)。3.从数值分布上看Ile/Val及Val/Val基因型的患者TNM分期偏晚,临床病理分期靠后,分化程度偏低。但经过Cochran-Mantel-Haenszel法检验后,p值均>0.05(0.9523,0.9098,0.8277),没有显著性差异。4.不同性别的HER-2基因型分布,经Cochran-Mantel-Haenszel法检验,统计量为0.0118 ,p值为0.9941>0.05,无显著相关。病例组中具有阳性家族史的患者共22例,对照组中阳性家族史例数为0。经Cochran-Mantel-Haenszel法检验,统计量为0.2473 ,p值为0.8837>0.05,无显著相关。5.抽取进行HER-2蛋白表达情况分析的56例患者中,HER-2蛋白阴性表达29例,阳性表达27例,利用Fisher精确概率法进行统计学分析,结果表明:Ile/Val,Val /Val基因型蛋白表达阳性率较高, p值为0.0104<0.05,具有统计学差异。6.对所有病例进行了nm23、p53、Ki-67、TOPII表达的统计。nm23阳性的病例共81例,p53阳性的病例共77例,Ki-67阳性病例共108例,TOP-II阳性病例共77例,经过卡方检验,p值分别为:0.9252,0.9953,0.9894,0.9794,均>0.05,均无明显差异。实验结论1、胃癌患者Ile/Val或Val/Val基因型出现的频率显著增高;2、与Ile/Ile相比,Val/Val基因型发病的风险率显著增加,Ile/Val型次之;3、胃癌患者基因型分布与临床分期及病理学分级无明显相关;与性别及家族史无明显相关;4、Ile/Val、Val/Val基因型病例中HER-2蛋白表达阳性率较高,具有统计学意义;5、nm23、p53、Ki-67、TOPII的表达与基因型分布无明显相关性。