论文部分内容阅读
脑缺血/低氧预适应(I/HPC)是缺血/低氧预刺激诱发的一种内源性保护现象,对其发生发展细胞信号转导机制的理解,可为临床脑卒中防治提供新思路和更有效的应用方向。I/HPC为预先给予机体亚致死性的缺血/低氧刺激,可明显提高脑组织对继发缺血/低氧性损伤的耐受能力,但其发生发展机制尚不清楚。本课题组以往研究发现,经典型蛋白激酶C(cPKC)βⅡ,γ和新奇型PKC(nPKC)ε参与了I/HPC的发生发展过程。然而,cPKCβⅡ,γ和nPKCs通过调节哪些重要信号分子通路介导I/HPC对缺血脑的保护作用还未可知。据此,本研究拟利用蛋白质组学技术鉴定参与脑I/HPC形成机制的cPKCβⅡ,γ和nPKCe相互作用蛋白基础上,进一步应用KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)通路富集分析,网络构建等生物信息学方法,解析参与I/HPC形成的cPKCβⅡ,γ,nPKCε特异性信号网络,分析cPKCβⅡ调节的蛋白质互作(PPI)网络拓扑结构,同时对cPKCβⅡ调节关键节点氧化磷酸化通路进行了实验验证。
实验在室温20-22℃下进行,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14W,18-22g),动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIHPublicationNo.80-23)进行。蛋白质组学分析中,动物分为对照(C0n)和HPC组(低氧暴露4次)。cPKCβⅡ调节的氧化磷酸化通路验证实验中,动物分为常氧组,HPC12h、24h和48h,HPC+cPKCβⅡ抑制剂LY333531,常氧组+cPKCβⅡ抑制剂LY333531后12h、24h和48h等10组。应用线粒体提取试剂盒对小鼠脑皮质胞浆成分进行线粒体提取,检测线粒体呼吸链复合体活性及cPKCβⅡ抑制剂对其的影响;应用蛋白印迹(Westernblot)方法,观察不同时间点脑皮质组织内NDUFV2等蛋白表达量变化及cPKCβⅡ抑制剂对其影响;应用SY5Y细胞,检测了给予低氧预适应及cPKCβⅡ抑制剂LY333531之后ROS生成及细胞活力的变化情况,细胞实验分为HPC(低氧预处理1%±0.4%氧浓度20分钟)6h、12h和24h,HPC+cPKCβⅡ抑制剂LY333531,常氧组+cPKCβⅡ抑制剂LY333531后6h、12h和24h等10组。实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理,以均数±标准差(x±S.D.)表示,其中p＜0.05为差异显著。结果如下:
1.参与小鼠脑低氧预适应cPKCβⅡ,γ,nPKCs相互作用蛋白的文档建立。
为了进一步揭示参与低氧预适应对缺血脑保护作用的cPKCβⅡ,γ,nPKCs亚型特异性信号网络,本课题组利用特异性的cPKCβⅡ,γ,nPKCs抗体分别对cPKCβⅡ,γ,nPKCs及其相互作用蛋白组成的复合物依次进行免疫沉淀,双向电泳分离和MALDI-TOF-MS鉴定,总共鉴定得到cPKCβⅡ相互租用蛋白38个,发生显著变化(变化超过1.5倍)的蛋白10个;cPKCγ相互作用蛋白24个,发生显著变化的蛋白17个;nPKCs相互作用蛋白27个,发生显著变化的蛋白8个。我们将得到的蛋白文档,在PUBMEDENTREZ数据库中将其转换位基因代号,在后续的分析中应用该文档。
2.小鼠脑低氧预适应cPKCβⅡ,γ,nPKCs及相互作用蛋白KEGG通路富集分析。
我们应用KEGG等数据库,采用基于超几何分布的通路富集分析方法对以上PKC亚型特异性相互作用蛋白进行分析,得到cPKCβⅡ及相互作用蛋白富集通路:线粒体内膜氧化磷酸化通路(p＜0.05)、神经变性疾病通路(帕金森氏病,阿尔茨海默病,亨廷顿病)(p＜0.05)、缝隙连接通路(p＜0.05);线粒体内膜氧化磷酸化通路;cPKCγ及相互作用蛋白富集通路:糖酵解/糖原再生通路(p＜0.05)、果糖和甘露糖代谢通路(p＜0.05);nPKCs相互作用蛋白富集通路:糖酵解/糖原再生通路(p＜0.05)、三羧酸循环通路(p＞0.05)、朊蛋白通路(p＞0.05)。PKC亚型及相互作用蛋白HPC中的通路富集分析结果提示cPKCβⅡ,cPKCγ及nPKCs在HPC中的脑保护作用是通过调节这些通路,特别是代谢相关通路实现的。
3.小鼠脑低氧预适应cPKCβⅡ,γ,nPKCε及相互作用蛋白KEGGSPIDER分析。
在得到了重要的富集通路之后,我们应用KEGGSPIDER进一步对所得富集通路内的蛋白之间的具体机制进行分析,得到cPKCβⅡ,γ,nPKCs调控KEGG子通路。结果显示:在cPKCβⅡ及其相互作用蛋白中ATP5B,ATP5A,Atp5d与间接蛋白AtpSh在功能和结构上有密切联系,同时与线粒体质子传递链蛋白SLC25A5,SLC25A4以及COX1有密切联系,提示cPKCβⅡ对其线粒体复合体功能的调节作用(p＜0.01);在cPKCγ及其相互作用蛋白中,Aco2,Idh3a,Pkm2,Tpil,Gapdh,Pgk1,Eno1,Eno2在糖酵解/糖原再生通路和三羧酸循环通路中密切联系(p＜0.01);在nPKCε及其相互作用蛋白中Pgk1,Gapdh,Aldoa,Tpil及Pkm2在糖酵解/糖原再生通路中与BPGM间接相互联系(p＜0.01)。
4.小鼠脑低氧预适应ePKCβⅡ,γ,nPKCs显著差异相互作用蛋白所在通路网络构建分析。
对于cPKCβⅡ,γ,nPKCc调控通路之间的关系,我们进行了KEGG通路网络构建,结果提示PKC各亚型共同调控代谢相关通路,如糖代谢,谷氨酸代谢及细胞骨架相关神经生长通路如轴突生长通路来实现预适应神经保护作用。
5.小鼠脑低氧预适应cPKCβⅡ相互作用蛋白PPI网络构建分析及GO分析。
对所得到的cPKCβⅡ相互作用蛋白,应用MINT、DIP等公用的蛋白互作数据,应用超几何分布法对cPKCβⅡ及相互作用蛋白进行了网络构建。通过对该PPI网络拓扑性质的分析,得到在所得的网络中氧化磷酸化通路蛋白NDUFV2,ATP5D,ATP5B,ATP5A具有较高的连通度和介数,提示其为重要的信号通路节点。同时GO功能注释分析,其中cPKCβⅡ调控氧化磷酸化通路中的蛋白在线粒体内膜,胞浆等部位,参与了神经再生,氧化磷酸化,呼吸链电子传递,ATP生成等生物过程;发挥了NADH还原酶活性,质子传递活性,酶活性等分子功能。
6.小鼠脑低氧预适应cPKCβⅡ及相互作用蛋白富集氧化磷酸化通路功能验证。
应用生物化学实验的方法对cPKCβⅡ调控氧化磷酸化通路在HPC中功能进行了检测。结果提示,线粒体复合体Ⅰ和线粒体复合体Ⅴ的活性在HPC中升高,且该变化呈cPKCβⅡ依赖。应用Westernbioting检测cPKCβⅡ相互作用蛋白NDUFV2,ATP5A,ATP5B等在HPC中的变化,结果显示,在给予低氧预适应刺激12h,24h,48h,与正常组比较,NDUFV2等明显升高,其中以24h(p＜0.05,n=6)最为明显。然而,预先给予脑室内注射cPKCβⅡ抑制剂LY333531(5μl,200nM)后则NDUFV2在小鼠脑皮层内降低(p＜0.05,n=6)。NDUFV2的变化与线粒体复合体Ⅰ活性改变相一致,而且一定程度上影响了线粒体复合体Ⅴ的活性。
应用SY5Y细胞系,对HPC(20分钟1%±0.4%氧预刺激)后及cPKCβⅡ抑制剂IN333531后6h,12h,24h,应用DCF试剂盒检测ROS的生成,及MTT法检测细胞活力。结果显示,给予低氧预刺激后,ROS生成增多(p＜0.05,n=12),同时该变化可以被cPKCβⅡ抑制剂所取消(p＜0.05,n=12)。但是,细胞活力在此过程中未发生明显变化。该结果提示,cPKCβⅡ通过调节氧化磷酸化通路进而影响ROS的生成来参与预适应的发生发展过程。
总之,本研究在鉴定出参与鼠脑HPC形成的cPKCβⅡ,γ和nPKCs相互作用蛋白基础上,应用富集分析等生物信息学方法鉴别出相关KEGG通路,构建了信号蛋白互作网络,并挖掘HPC脑保护作用的功能模块;同时应用生物化学等方法,验证了参与HPC形成的cPKCBII调控的氧化磷酸化通路。对参与脑I/HPC形成的PKC亚型特异性信号通路的解析将进一步丰富人们对PKC亚型特异性信号转导的理解,并为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供实验依据。