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目的:1.回顾性分析单中心1215例APL患者中不典型APL的发生情况,并应用荧光原位杂交(FISH)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和RNA测序进行重分类,了解除外t(15;17)/PML-RARa,其它X-RARa的发生情况;应用高通量DNA基因测序,筛查此类患者有无协同的基因事件。2.鉴定2例伴STAT3-RARa融合基因的APL,克隆融合基因全长,构建各种相关的表达质粒,以便于进行相关的功能研究。3.通过体外实验了解STAT3-RARa和STAT5B-RARa蛋白的亚细胞定位,STAT5B-RARa对细胞分化凋亡、集落形成的影响,以及研究STAT5B-RARa对全反式维甲酸(ATRA)的耐药机制,为探索这类白血病的靶向治疗奠定基础。方祛:1.筛选1215例初诊APL患者的MICM数据,其中有40例临床症状、骨髓细胞形态学和流式免疫分型符合APL诊断,但常规细胞遗传学分析无t(15;17)(q24;q21),PML-RARa探针FISH检测阴性;RT-PCR技术未检测到PML-RARA融合转录本,应用FISH、RT-PCR和RNA测序进行重分类,并分析各组患者的临床及实验室特征;通过二代测序技术鉴定不典型APL患者的伴随基因事件。2.分析2例新发现的STAT3-RARa阳性APL患者的临床与实验室特征;通过全基因组测序精确定位STAT3-RARa在基因组上的断裂位置及这一事件的发生过程;RT-PCR技术克隆STAT3、RARa、RXRa、STAT3-RARa全长基因,构建各种基因的pcDNA3.1表达质粒。3.进行免疫荧光实验,以明确STAT3-RARa、STAT5B-RARa融合蛋白的亚细胞定位。在已构建好STAT5B-RARa稳转细胞株的基础上,流式检测维甲酸、三氧化二砷分别对细胞分化和凋亡的影响;肿瘤细胞集落形成观察STAT5B-RARa对HL60细胞生长增殖情况的影响;荧光素酶报告基因检测RARE启动子区的转录活性;免疫共沉淀(CO-IP)检测PcG蛋白转录抑制复合物PRC1核心成份BMI1与STAT5B-RARa融合蛋白之间的相互作用关系。结果:1.不典型APL患者的临床和实验室特征研究重分类后将40例不典型APL患者分成2组:X-RARa病例简称为变异型,其余病例简称为染阴融阴型。与t(15;17)/PML-RARa阳性的典型APL相比较,变异型组患者多为男性,初诊白细胞总数和血小板总数偏高,且临床完全缓解率低(94.8%&31.7%,p<0.001),复发率高(14.4%&75.0%,p<0.001),总体治疗效果较差。17例变异型组中,有 10 例为 PLZF-RARa,4 例为 STAT5B-RARa,2例为 STAT3-RARa 以及1例为TBLR1-RARa。PLZF-RARa融合基因检测到e3-e3和e4-e3两种剪接异构体;STAT5B-RARa融合基因检测到e14-e3和e15-e3两种剪接异构体。发现一些基因突变与这两组特殊的APL病例相关,变异型组发生频率最高的为WT1,其次为SMARCB1、GATA2等;染阴融阴型组发生频率最高的为NPM1,其次为GATA2、FLT3 等。2.伴有STAT3-RARa阳性APL患者的基本特征和融合基因克隆2例新发现的STAT3-RARa阳性APL患者均为男性,具有特有的细胞形态学特征,经过ATRA/ATO联合治疗,骨髓涂片示治疗无反应,1例未缓解,1例经联合化疗方案获得临床缓解,至诊断后30个月复发。2例患者具有不同的剪接异构体,其中1例为STAT3基因第23号外显子与RARa基因第3号外显子拼接而形成;另1例为STAT3基因第21号外显子与RARa基因第3号外显子拼接而形成。全基因组测序分析结果指出STAT3基因与RARa基因之间存在约1.96Mb的基因组缺失,此外,RARa基因在exon9处发生断裂并形成自身的一个倒位。成功克隆了 STAT3-RARa全长,构建了 STAT3-RARa及其相关的各种表达载体。3.STAT3-RARa和STAT5B-RARa融合基因的功能研究免疫荧光显示STAT3-RARa和STAT5B-RARa融合蛋白都主要存在于细胞核内,呈明显的富集状态,而细胞浆中仅有弥散性的表达。体外研究显示STAT5B-RARa转细胞在ATRA作用不同时间CD11b表达阳性细胞比例逐步增高,但较空载体细胞有明显差别。流式细胞可见转染组总凋亡细胞比率明显低于空载体组,且主要以早期凋亡细胞减少为主。STAT5B-RARa细胞克隆集落形成率较空载体细胞增高,经ATRA处理后,并不能明显降低其集落形成的能力。当STAT5B-RARa与RARE共转染时,其转录活性明显下降,加入一定范围浓度的RA作用后,也不能解除对RARE启动子区的转录活性。CO-IP和Western Blot结果显示在转染细胞体内BMI1蛋白与STAT5B-RARa融合蛋白存在直接的相互作用关系,且应用ATRA处理后并不能去除两个蛋白之间的相互结合。结论:1.不典型APL具有与典型t(15;17)(q22;q21)/PML-RARa阳性APL患者不同的临床和实验室特点。运用FISH、RT-PCR和RNA测序可发现一些少见、罕见型的携带X-RARa的变异型APL,且部分融合基因可具有二种剪接异构体。不典型APL的基因突变图谱与典型APL明显不同。其中WT1、SMARCB1和GATA2等可能与变异型APL相关,NPM1、GATA2、FLT3等可能与染阴融阴型APL相关。提示这2组APL病例存在不同于典型APL的疾病发生机制。2.发现了 2例新的伴有STAT3-RARa融合基因的APL病例,这在国内外尚属首次报道,STAT3-RARa将成为第14种APL相关的融合基因。STAT3-RARa的APL具有一些不同于典型APL的特点,明确了 STAT3-RARa融合基因在DNA上精确的断裂位置,并指出至少有2个事件(缺失、倒位)参与这一过程。3.明确了 STAT3-RARa、STAT5B-RARa融合蛋白的亚细胞定位。体外实验证实STAT5B-RARa转细胞株对ATRA或三氧化二砷作用不敏感;细胞生长增殖潜能较高。STAT5B-RARa通过显性负作用抑制RARE启动子的转录,并且ATRA并不能逆转STAT5B-RARa对RARE的抑制作用。STAT5B-RARA融合蛋白与BMI1蛋白存在直接相互作用关系,且ATRA并不能解除两者之间的异常结合,这可能是ATRA耐药机制之一。