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该研究以四膜虫为材料,获得野型及定点诱变的Ⅰ型内含子核酶并检测其自我剪接功能;然后以次为模板构建修复GFP的反式剪接核酶并检测其修复功能.1.野生型嗜热四膜虫核酶的获得和鉴定:提取嗜热四膜虫DNA,以之为模板通过PCR扩增出Ⅰ型内含子核酶序列,将其与pGEM-T载体连接后构建获得重组pGEM-rib质粒,经酶切鉴定正反向后将正向重组pGEM-rib质粒送予测序,证实获得质粒为具有体外转录Ⅰ型内含子核酶基因的质粒.2.突变型核酶载体的构建和转录和鉴定:通过比较几种与嗜热四膜虫相近的Ⅰ型内含子核酶的序列差异以及Ⅰ型内含子核酶二级结构的特点,选择3个具有序列差异的非发夹结构位点,分别以之为突变位点设计引物,以嗜热四膜虫Ⅰ型内含子核酶为模板,经嵌套PCR的方法扩增获得3种突变Ⅰ型内含子核酶PCR产物.3种PCR产物分别与pGEM-T载体连接后构建获得重组pGEM-cis1,pGEM-cis2,pGEM-cis3质粒,酶切鉴定正反向后送予测序,证实所构建的质粒包含设计的突变Ⅰ型内含子核酶基因序列.3.1、体外表达缺失突变绿色荧光蛋白基因质粒的构建和鉴定:为检测Ⅰ型内含子核酶的反式剪接功能,该实验拟构建含有缺失后半段基因序列的绿色荧光蛋白(GFP)的突变重组质粒,同时构建包括绿色荧光蛋白后半段基因序列的反式剪接核酶重组质粒,然后以反式剪接核酶修复突变绿色荧光蛋白,以检测反式剪接核酶的剪接效果.3.2、缺失突变型pEGFP-C2质粒的构建和鉴定:将PCR扩增的pEGFP-C2的436~935bp的基因片段连接pMD18-T载体后获得XYQ5/10-pMD18质粒,酶切鉴定该重组质粒后,取反向质粒以NheⅠ,HindⅢ双酶切,将酶切的插入片段电泳后回收;同时以NheⅠ,HindⅢ双酶切pEGFP-C2质粒,将酶切线性质粒片段电泳后回收;将两回收片段连接获得突变pEGFP-C2重组质粒.将重组质粒送予测序证实突变pEGFP-C2质粒缺失后半段基因序列的绿色荧光蛋白.3.3、修复突变绿色荧光蛋白的反式剪接核酶的构建:以pEGFP-C2质粒的806bp处为剪接位点,设计针对该特异剪接位点的IGS的反式剪接核酶.设计引物通过PCR分别获得Ⅰ型内含子核酶的有剪接能力的内含子基因片段及绿色荧光蛋白后半段基因序列片段,以这两个片段为模板,通过嵌套PCR获得带有后半段绿色荧光蛋白基因的反式剪接核酶基因序列片段.以pMD18-T载体为穿梭质粒将该片段转入CMV2质粒,获得能在细胞内外表达反式剪接活性的重组CMV2质粒.将该重组质粒送予测序,结果证实与设计一致的核酶基因序列已连接入CMV2质粒.将该重组CMV2质粒单酶切线性化后纯化回收酶切片段以备后用.3.4、体外反式剪接功能鉴定:以线性化XYQ5/10-pGEM质粒片段及线性化重组CMV2质粒为模板进行体外转录,然后以转录产物为模板进行RT-PCR,将结果跑电泳及测序证实RT-PCR产物为反式剪接后的产物,从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能.3.5、体内反式剪接功能鉴定:将重组突变pEGFP-C2质粒及重组CMV2质粒共转染Hela细胞,用荧光显微镜观察转染结果,发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光,证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能,不过其反式剪接效率比较低.