论文部分内容阅读
背景：1887年意大利生理学家Ruggero Oddi首次描述了十二指肠降部胆胰管开口处存在括约肌，此后被命名为Oddi括约肌(Sphincter of Oddi,SO）[1]。Oddi括约肌（Sphincter of Oddi，SO）独立于十二指肠壁，末端开口于十二指肠大乳头的括约肌，是胆汁排出胆道的唯一门户，调节胆胰液的分泌，维持胆管内低压、低流量系统内环境的稳定[2,3]。Oddi括约肌功能障碍（Sphincter of Oddi dysfunction,SOD）是指由SO解剖狭窄或括约肌蠕动障碍导致的一系列临床病理表现的疾病。根据SOD分型罗马Ⅲ标准，将SOD分为胰管SO功能障碍和胆管SO功能障碍。胰管型SOD又可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。本实验旨在研究胰管型SOD芍药甘草汤治疗后的疗效观察。芍药甘草汤源自张仲景的《伤寒论·辨太阳病脉证并治》[4]。由白芍药、炙甘草等组成，因白芍药中有效成分为芍药甙，而芍药甙具有较好的解痉作用，在炙甘草中，有效成分主要为甘草酸，甘草酸具有抗炎作用[5]。芍药甘草汤是较为常用的缓急止痛方剂，经实验研究证实，有镇静、止痛及松弛平滑肌等作用，目前在临床上，已经广泛应用于呼吸、消化系统的病症。芍药甘草汤缓急止痛作用与其能够解除平滑肌痉挛状态相关。已证实高胆固醇血症可使兔SO发生动力异常改变，导致SO运动功能紊乱，舒缩功能受损。L型钙通道是决定平滑肌舒缩功能的电压门控性钙离子通道，其中1亚基是其功能亚基。钙离子通过L-型钙通道的内流触发肌肉收缩机制已被公认。文献表明中药芍药的有效成分芍药甙（Paeoniflorin，PF）可以舒张胃肠道平滑肌[6]，也有文献证实PF对家兔离体SO肌环同样有舒张作用[7]。但芍药甙舒张SO具体机制尚未见相关报道。为进一步探究芍药甙舒张SO作用的相关机制，本研究实验部分拟采用Real-time PCR和Western Blotting方法观察不同浓度芍药甙治疗后的高胆固醇血症兔SO细胞L型钙通道1C亚单位mRNA和蛋白表达的变化，采用全细胞膜片钳技术观察不同浓度的芍药甙对高胆固醇血症兔L型钙离子通道电流（ICa，L）的影响。目的：第一部分：应用芍药甘草汤治疗临床常见的胰型SOD患者并观察其疗效。第二部分1.观察高胆固醇血症对兔SO细胞L型钙通道1C亚单位mRNA和蛋白表达的影响；2.探讨不浓度的芍药甙对高胆固醇血症兔L型钙通道1c亚单位mRNA和蛋白表达的影响；3.研究不同浓度的芍药甙对正常和高胆固醇血症兔L型钙离子通道电流的影响；4.探讨芍药甙舒张SO的作用机制，为临床治疗SOD提供理论依据。方法：第一部分：1.采集大连医科大学附属第一医院门诊及住院患者标本，患者于门诊就诊或入院时间为2009年1月-2010年12月，采集胆囊切除术后患者，符合罗马Ⅲ诊断标准并符合胰型SOD诊断的患者进行入组，入组病例共39例（其中包括Ⅰ型2例，Ⅱ型13例，Ⅲ型24例），选中入组后将患者随机分成2组：1.1.治疗组：23例，男性10例，女性13例，年龄35～58岁，平均年龄59.3±18.8岁；初次发病时间为术后16～57个月，平均20.3±2.4个月（其中胰型Ⅰ型1例，Ⅱ型8例，Ⅲ型例14例）；1.2.对照组：16例，男性5例，女性11例，年龄35～58岁，平均52.7±20.1岁；初次发病时间为术后16～57个月，平均19.4±2.9个月（其中胰管Ⅰ型1例，Ⅱ型5例，Ⅲ型10例）。2.两组患者门诊接诊或入院后行纠正电解质紊乱、抗感染等治疗，在治疗过程中均未给予解痉药物。对照组口服安慰剂（凉茶），治疗组口服芍药甘草汤。3.观察中药芍药甘草汤的治疗效果，并在12个月的时间内对患者进行随访，以疼痛减轻、肝功能胰腺淀粉酶，脂肪酶恢复为观察指标，对其疗效做出评价。第二部分：1.健康纯种新西兰大白兔随机分为2组，即对照组（Concrol,CON）、高胆固醇血症组（Hypercholesterolemia,HC）。对照组饲以标准兔饲料，高胆固醇血症组以标准饲料+胆固醇，饲养8周，诱发高胆固醇血症。2.提取CON组和HC组SO细胞，行原代培养，免疫组织化学法鉴定，并将HC组SO细胞分为三组，分别用含PF10-7mol/L，10-6mol/l,10-5mol/L的培养基孵育12H，CON组用正常培养基孵育12H。对CON组、0.1μmol/L的PF处理组、1μmol/L的PF处理组、10μmol/L的PF处理组别进行Real-time PCR和WesternBlotting实验，分析各组L型钙通道1C亚单位mRNA和蛋白表达量的变化。用目的条带和GAPDH条带灰度值的比值表示目的mRNA的相对表达量;用目的通道条带灰度值与GAPDH条带光密度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。3.采用全细胞膜片钳(whole cell patch clamp)技术，记录不同浓度的芍药甙对正常和高胆固醇血症兔ICa，L的作用。结果：第一部分：治疗组中有效16例（Ⅰ型0例，Ⅱ型有效3例，Ⅲ型有效13例），总有效率（69.6%），1年后复发4例（Ⅱ型1例，Ⅲ型3例）复发率25%；对照组中有效2例（Ⅰ型0例，Ⅱ型1例，Ⅲ型1例），有效率12.5%，1年后复发2例（Ⅱ型1例，Ⅲ型1例）复发率100%。第二部分：1.高胆固醇血症可升高L型钙通道1C亚单位mRNA和蛋白表达水平；2.PF可以明显降低高胆固醇血症兔L型钙通道1C亚单位mRNA和蛋白表达水平，而且与芍药甙浓度有一定的依赖性；3.全细胞膜片钳证实0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L的PF能显著抑制ICa,L电流峰值，并且具有浓度依赖性，可使I-V曲线上移。结论:第一部分：口服芍药甘草汤对胆囊切除术后胰型Ⅱ、Ⅲ型SOD治疗效果显著，芍药甘草汤治疗具有疗程短、见效快、能够改善肝功能、治疗后复发率低等优点，对胰型Ⅰ型SOD无明显疗效。第二部分：1.SO细胞L型钙离子通道蛋白表达量的变化应该是HC兔钙离子通道活性上调的原因之一，芍药甙可以通过下调L型钙通道蛋白表达量起到舒张SO的作用；2.PF对高胆固醇血症兔L型钙通道1C亚单位mRNA和蛋白表达水平下调作用具有剂量依赖性，10μmol/L的PF处理组作用较强；3.PF对ICa,L具有明显抑制作用，这可能是其舒松平滑肌的机制之一；