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研究背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)是缺血性心脑血管病的病理基础,慢性炎症和免疫反应在As发展及并发症产生中起着关键作用,但其发病机制未完全清楚。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是细胞表面识别病原相关分子模式的受体家族,在免疫反应和慢性炎症的相互作用中起重要作用,已成为研究As发病机制的热点领域。TLR4是第一个被发现的人类TLRs家族成员,通过识别自身配体参与炎症反应和免疫过程调节。目前,TLR4作为新的炎症信号传递门户蛋白在As发生发展中的作用亦日益引起关注。C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是一种主要由肝脏合成的急性时相反应蛋白,其水平增高是体内炎症的敏感指标。血浆CRP水平与As的发生、发展及预后有直接的联系,并且与As的危险因素也有一定的相关性。此外,CRP可直接参与As的整个病理过程包括内皮细胞的损伤、单核细胞的粘附聚集、泡沫细胞的形成和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的迁移增殖等。体外研究证实,CRP可通过激活多条信号通路,最终活化核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB),导致血管细胞释放大量炎性因子、粘附分子及生长因子,诱发血管壁炎症反应,促进As的发生和发展。然而,CRP致炎效应与TLR4之间的关系及相关信号通路,国内外报道尚存在争议。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)是一类核受体超家族成员,包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ三种亚型,其中以PPARγ的研究较深入。已证实,PPARγ激动剂罗格列酮直接或间接作用于血管壁,发挥抗炎作用,从而减缓As的进程。目前认为,罗格列酮的抗炎作用存在PPARγ依赖性及非依赖性两种机制,并且其作用机制是否与干扰TLR4的信号途径有关还有待进一步探索。研究目的:1.观察CRP对VSMCs中TLR4及炎性因子表达的影响,并探讨CRP的致炎效应与TLR4信号通路的关系,为阐明As的发病机制提供新的理论依据。2.研究罗格列酮对CRP刺激的VSMCs中TLR4及炎性因子表达的影响和信号转导途径,以期阐明PPARγ激动剂抗炎和抗As作用的新机制。研究内容和方法:1. CRP诱导VSMCs中TLR4及炎性因子表达的研究培养大鼠VSMCs,以不同浓度CRP(10、25、50μg/ml)和LPS(100 ng/ml)刺激细胞9 h或30 min,然后采用细胞免疫荧光染色法检测VSMCs中TLR4和GR表达,real-time PCR和western blot法检测VSMCs中TLR4、VEGF-A、iNOS、PPARγ及GR的mRNA和蛋白表达。2. CRP诱导VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路研究培养大鼠VSMCs,按照试剂盒说明用DharmaFECT 2转染试剂将TLR4 siRNA或negative control siRNA(NC siRNA)瞬时转入VSMCs 48 h后,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h或30 min,real-time PCR和western blot法测定VSMCs中VEGF-A、iNOS、PPARγ及GR的mRNA和蛋白表达。预先30 min加入AT1R抑制剂losartan、AT2R抑制剂PD123319、p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂PD098059、JNK抑制剂SP600125或不同的联合,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h,同法检测VSMCs中TLR4 mRNA和蛋白表达。预先30 min加入AT1R抑制剂losartan、p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂PD098059、JNK抑制剂SP600125,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h,western blot法检测VSMCs中VEGF-A及iNOS蛋白表达。预先30 min加入AT1R抑制剂losartan,再用25μg/ml CRP刺激细胞30 min,同法检测VSMCs中p38的磷酸化水平。采用TLR4 siRNA或NC siRNA瞬时转染VSMCs 48 h后,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h,real-time PCR和western blot法检测VSMCs中PKCα表达。采用PKCα的抑制剂G? 6976预先孵育1 h,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h,western blot法测定VSMCs中VEGF-A和iNOS的蛋白水平。采用PKCαsiRNA或NC siRNA瞬时转染VSMCs 48 h后,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h或30 min,real-time PCR和western blot法检测VSMCs中IRF3 mRNA和蛋白表达。采用IRF3 siRNA或NC siRNA瞬时转染VSMCs 48 h后,再用25μg/ml CRP刺激细胞9 h或30 min,western blot法检测细胞中NF-κB p65和IκBα表达。3.罗格列酮对CRP刺激VSMCs中TLR4及炎性因子表达的干预研究培养大鼠VSMCs,预先2 h加入罗格列酮(5、10、20μM),再用25μg/ml CRP刺激9 h或30 min。采用细胞免疫荧光染色法检测VSMCs中TLR4和GR表达,real-time PCR和western blot法检测VSMCs中TLR4、VEGF-A、iNOS、PPARγ及GR的mRNA和蛋白表达。4.罗格列酮拮抗CRP诱导VSMCs炎症反应的TLR4信号通路研究采用TLR4 siRNA或NC siRNA瞬时转染VSMCs 48 h后,再给予罗格列酮(10μM)作用2 h,然后用25μg/ml CRP刺激细胞9 h,real-time PCR和western blot法测定VSMCs中VEGF-A及iNOS的mRNA和蛋白表达。预先30 min加入SB203580或预先1 h加入PPARγ阻断剂GW9662或GR阻断剂RU486,再给予罗格列酮(10μM)作用2 h,然后用25μg/ml CRP刺激细胞9 h,western blot法检测VSMCs中TLR4蛋白表达。预先1 h加入GW9662或RU486,再给予罗格列酮(10μM)作用2 h,然后用25μg/ml CRP刺激细胞30 min,同法检测VSMCs中p38的蛋白磷酸化水平。预先1h加入GW9662,再给予罗格列酮(10μM)作用2 h,然后用25μg/ml CRP刺激细胞30 min,同法检测VSMCs中GR的蛋白磷酸化水平。研究结果:1. CRP对VSMCs中TLR4和炎性因子产生的影响结果显示,CRP增加了VSMCs中VEGF-A、iNOS和TLR4 mRNA及蛋白的表达,且呈明显的浓度依赖性(P<0.05或P<0.01);CRP亦可显著降低VSMCs中PPARγ和GR mRNA和蛋白水平(P<0.01)。免疫荧光染色的结果表明,CRP浓度依赖性的增加VSMCs上TLR4的表达,并且抑制GR的核转位现象。2. CRP刺激VSMCs产生炎性因子的TLR4信号通路TLR4 siRNA可下调CRP诱导的VSMCs中VEGF-A和iNOS的mRNA及蛋白表达,上调CRP诱导的VSMCs中PPARγ及GR的mRNA及蛋白水平(P<0.05)。结果表明,TLR4介导了CRP诱导的VSMCs中VEGF-A、iNOS的表达及PPARγ、GR的下调。Losartan、SP600125、SB203580 or PD098059抑制CRP诱导的TLR4的mRNA和蛋白表达,而PD123319并无此作用。而且, losartan与SP600125、SB203580 or PD098059合用对TLR4表达的抑制作用更加明显。结果表明,CRP通过AT1R和MAPK诱导VSMCs中TLR4的表达。Losartan和SB203580明显抑制CRP诱导的VSMCs中TLR4及下游分子VEGF-A和iNOS的表达(P<0.01); SP600125和PD098059对CRP诱导的VSMCs中VEGF-A和iNOS的蛋白表达也有降低作用,但统计学无显著性差异。另外,losartan可显著下调CRP诱导的p38磷酸化水平(P<0.01),表明AT1R可作为p38的上游信号分子,促进其活化。以上结果提示,CRP可经由AT1R—p38通路激活TLR4,继而促进下游分子VEGF-A和iNOS的表达。CRP增加VSMCs中PKCαmRNA和膜蛋白的表达,阻断TLR4可减少CRP诱导的VSMCs中PKCα表达(P<0.01);PKCα的抑制剂G? 6976可显著抑制CRP刺激的VSMCs中VEGF-A和iNOS的表达(P<0.01或P<0.05)。说明PKCα可能位于TLR4致炎信号通路的下游,参与调节CRP诱导的VSMCs中VEGF-A和iNOS表达。CRP明显增加VSMCs中IRF3 mRNA表达和蛋白磷酸化,PKCαsiRNA可减少CRP诱导的VSMCs中IRF3的表达(P<0.01),说明CRP可能通过PKCα激活IRF3而发挥致炎作用。CRP促进VSMCs核内NF-κB p65蛋白表达以及IκBα的磷酸化水平,而IRF3 siRNA可降低CRP诱导的VSMCs中NF-κB p65和IκBα的活化(P<0.01),表明CRP可能通过IRF3而活化NF-κB,引发VSMCs的炎症反应。3.罗格列酮对CRP刺激VSMCs中TLR4及炎性因子表达的影响结果显示,罗格列酮不仅抑制了CRP诱导的VSMCs中VEGF-A、iNOS和TLR4的mRNA及蛋白表达(P<0.01),而且可增加CRP下调的VSMCs中PPARγ和GR mRNA及蛋白表达或活化(P<0.01)。免疫荧光染色的结果显示,罗格列酮可显著降低CRP诱导的VSMCs上TLR4表达,同时促进GR的核转位现象。4.罗格列酮拮抗CRP致炎效应的TLR4信号通路的研究与NC siRNA相比,TLR4 siRNA可减少CRP诱导的VSMCs中VEGF-A和iNOS表达(P<0.01),罗格列酮也可抑制CRP诱导的VSMCs中VEGF-A和iNOS表达,而且二者联合应用具有增强效应(P<0.01)。结合前面实验结果罗格列酮可显著抑制CRP诱导的TLR4表达,因此我们推测罗格列酮抑制CRP诱导的VSMCs中VEGF-A和iNOS的表达依赖于TLR4的表达下调。SB203580单独使用可以抑制CRP诱导的TLR4蛋白表达(P<0.01),而且SB203580与罗格列酮合用可加强其抑制TLR4的作用(P<0.05);GW9662对罗格列酮抑制TLR4表达的作用无明显影响,而RU486却部分逆转了罗格列酮下调TLR4表达的作用(P<0.01)。以上结果表明,p38和GR可能参与了罗格列酮对TLR4表达的影响,而PPARγ对此无显著的作用。另一实验表明,CRP可增加p38磷酸化水平(P<0.01),罗格列酮对此有显著下调作用(P<0.01);RU486可部分逆转罗格列酮对p38的抑制作用(P<0.01),而GW9662对此无明显影响。结果说明,罗格列酮可能通过活化GR进一步干扰p38—TLR4信号途径,从而抑制CRP诱导的VSMCs炎症反应。进一步的实验发现,CRP显著下调VSMCs中GR的磷酸化水平(P<0.01),罗格列酮可明显逆转这一效应(P<0.01),然而GW9662对罗格列酮诱导的GR表达无明显影响,表明罗格列酮诱导的GR活化与PPARγ无明显的联系,提示罗格列酮的抗炎作用存在PPARγ非依赖的机制。研究结论:1. CRP促进大鼠VSMCs中VEGF-A和iNOS的表达;CRP上调大鼠VSMCs中TLR4表达,下调PPA Rγ及GR表达。2. TLR4依赖的信号通路(AT1R—p38—TLR4—PKCα—IRF3—NF-κB)介导CRP对VSMCs的致炎反应,这一发现不但有助于阐明CRP致炎及致As的新机制,而且为As的药物防治提供了新的靶点和途径。3.罗格列酮通过减少CRP诱导的大鼠VSMCs中VEGF-A和iNOS的表达,发挥抗炎作用;罗格列酮下调CRP诱导的大鼠VSMCs中TLR4表达,上调PPARγ及GR表达,缓解炎症反应。4. PPARγ激动剂罗格列酮通过调节CRP影响的VSMCs中促炎因子和抗炎因子之间的平衡,发挥抗炎及抗As作用。罗格列酮的抗炎作用不依赖于PPARγ的表达,而是通过活化GR继而干预p38—TLR4致炎信号通路实现的。因此,TLR4依赖的致炎信号通路有望成为PPARγ激动剂防治As一个新的靶途径。