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曼氏迭宫绦虫是最重要的绦虫种类之一,其幼虫—裂头蚴可以侵入人体皮下组织、腹腔、眼睛和中枢神经系统,导致一种严重的人兽共患寄生虫病——裂头蚴病。人体感染裂头蚴病主要是通过食入裂头蚴感染的蛙肉或蛇肉,误食感染有原尾蚴的剑水蚤,或用蛙肉、蛇肉(皮)敷贴皮肤的疮疖、伤口或脓肿等。裂头蚴病呈全球性分布,但大部分病例分布在东亚和东南亚国家。中国的裂头蚴病例为世界之最,自1949年以来,在27个省、市、自治区已有1,000多例报道。近年来裂头蚴病在我国局部地区有增加的趋势,在一些地区,裂头蚴病已经被列为新现的动物源性寄生虫病。对于裂头蚴的地理分布、种群遗传特征与其生态环境之间的相互关系的了解,有助于裂头蚴病的预防和控制。然而,目前有关裂头蚴种群遗传结构的研究还十分薄弱。因此,有必要对我国不同地区裂头蚴分离株进行遗传结构分析,从而有助于了解裂头蚴种群变化及遗传变异对其致病性的影响。本研究首先对中国西南部9个不同地区野生蛙类的裂头蚴自然感染情况进行了调查。然后,基于4个分子标记(cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1)对这些裂头蚴分离株的种群遗传结构进行了分析。在DNA多态性分析中,不同地区裂头蚴分离株之间表现出了高度的遗传多样性和遗传分化;系统发育推断和中接网络分析均支持西南地区裂头蚴种群可分为两个分枝。然而,中性检验、岐点分布分析和贝叶斯扩张动力学曲线等分析均未发现西南地区裂头蚴种群经历过扩张。最后,本研究还对中国东部、中部、南部以及西南地区的裂头蚴分离株进行系统发育分析,认为中国裂头蚴种群可能存在两个类群(类群Ⅰ和类群Ⅱ),且这两个类群在上新世中期开始分化。材料与方法1.裂头蚴的采集:在2013年5月到2014年9月之间,在我国西南部9个不同地区:四川(广安、泸州、绵阳、南充、南充营山)、云南(保山、德宏、昆明)及重庆(梁平)自然感染青蛙体内分离裂头蚴,放入5ml的冻存管中用无水乙醇保存并做好标记。2.目的基因的扩增及测序:使用通用型柱式基因组提取试剂盒对每一个裂头蚴分离株进行基因组DNA的提取,然后以基因组DNA为模板,使用PCR方法扩增4个分子标记:cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1,用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化,将纯化后的PCR产物送至金唯智公司进行双向测序,所有的序列均上传至Gen Bank数据库。3.序列比对及饱和度分析:首先使用Clustal X v.2.0程序对线粒体基因编码序列cytb和cox1进行比对。然后根据其氨基酸序列在MEGA v.5.0中进行校正。对于线粒体核糖体rrn S基因和核糖体28S r DNA D1序列,首先预测其二级结构,然后根据二级结构在MEGA v.5.0中进行比对。使用DAMBE v 5.2软件对分子序列进行核酸替代饱和性检验。此外,使用MEGA v.5.0来估算核苷酸组成、保守位点、变异位点、简约信息位点等。4.遗传结构分析:基于cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1的联合序列,使用Dna SP v.5.10进行单倍型(Haplotype)分析,并计算每个种群的遗传多态性。使用软件Network v.4.5中的平均邻接算法进行单倍型网络的重建。基于联合序列,使用Mr Bayes v.3.1来对西南地区裂头蚴分离株进行系统发育分析。基于联合序列,在软件Arlequin v.3.5.1.2中使用岐点分布分析评估裂头蚴种群的动态变化。依据观察到的和预测的错配分布之间的偏差平方和与平滑指数评估扩张模型的可靠性;同时,基于Fu’s FS检测和Tajima’s D检测进行中性检验。同样,使用Arlequin v.3.5.1.2进行分子差异度分析(AMOVA),以检测种群内部和种群之间的遗传多样性水平。使用群体遗传固定系数(Fst)值评估不同地理种群之间的遗传差异水平。5.系统发育分析:分别使用最大简约法(maximum parsimony,MP)、最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯推断法(Bayesian inference,BI)对我国东部、中部、南部和西南地区裂头蚴分离株进行系统发育分析。最大简约法在MEGA v.5.0中进行,系统树每一分枝的置信度采用自引导法重复检验,设置1000次重复;使用Phy ML软件进行最大似然分析;贝叶斯分析采用Mr Bayes v3.1软件进行;所有系统发育分析均运算两次。使用BEAST v1.6.1软件,基于松弛分子钟模型对cytb+cox1联合数据集对我国不同地区裂头蚴的分化时间进行估算。结果1.中国西南地区野生蛙类裂头蚴自然感染率:从中国西南部9个不同地区共采集野生蛙类276只,经形态学鉴定均为黑斑蛙(Rana nigromaculata)。在276只黑斑蛙中,55只发现有裂头蚴寄生,平均感染率为19.93%。西南不同地区野生黑斑蛙体内裂头蚴的感染率从8.33%到50.00%不等,最多的1只蛙体内可有31条裂头蚴寄生,最少的每只蛙有1条裂头蚴感染。四川地区蛙类裂头蚴的感染率高于其他地区,其中,四川南充地区黑斑蛙蛙的裂头蚴感染率最高,达到50.00%,感染强度为每只蛙有1~23条裂头蚴感染。2.裂头蚴DNA序列多态性:4个目的基因(cytb、cox1、rrns和28S r DNA D1)均得到成功扩增,其长度分别为1110 bp、1566 bp、280 bp和299 bp,且这些序列均未出现饱和现象,表明其适用于系统发育研究。4个基因联合序列(cytb+cox1+rrn S+28S)共鉴定出180个多态位点,其中161个是简约性信息位点,有19个是单一变异位点;在来自9个不同地理区域的52个裂头蚴地理株中,共鉴定出32个单倍型。每一地理种群及整个裂头蚴种群均具有较高的单倍型多态性。3.西南地区裂头蚴种群遗传结构:分子差异度分析(AMOVA)的结果显示裂头蚴种群之间的遗传差异度为57.31%,比种群内的(42.69%)要高一些。除了四川广安和四川绵阳之间及四川广安和四川南充之间的Fst值小于0.25以外,其他地区之间的群体遗传固定系数值均在0.25以上。系统发育树显示我国西南地区裂头蚴分离株可分为两个主要的分枝(分枝Ⅰ和分枝Ⅱ)。基于单倍型联合序列的中接邻接网络分析的结果同样显示,我国西南地区的裂头蚴存在两个单倍型子网络。基于宽松分子钟模型的分化时间估算表明,我国西南地区的裂头蚴分离株在上新世中期(2.91 Myr)开始分化。分枝Ⅰ的起源时间大约在上新世晚期(1.88 Myr),分枝Ⅱ在更新世早期(1.56Myr)开始分化。岐点分布分析结果显示,分枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整个种群的分布曲线均呈多峰分布状态,表明西南地区种群处于平衡阶段。贝叶斯扩张动力学曲线分析的结果同样不支持枝Ⅰ、分枝Ⅱ及整个种群存在明显的种群扩张。4.系统发育分析及分化时间估算:我国裂头蚴种群可分为两个主要类群:类群Ⅰ和类群Ⅱ,且这两个种群在上新世中期开始分化。所有来自河南、湖南、安徽、浙江及重庆的裂头蚴分离株均包含在类群Ⅰ中,类群Ⅰ大约在1.67 Myr(上新世晚期)开始分化。类群Ⅱ包含的裂头蚴分离株主要来自云南、海南和广西,此类群的起源时间被估算为上新世晚期(1.89Myr)。来自贵州、江苏和四川的分离株在两个分枝中均有分布。结论1.DNA多态性分析结果显示我国西南不同地区裂头蚴种群的遗传多态性及遗传差异均比较高;基于多基因联合序列(cytb、cox1、rrn S和28S r DNA D1)的系统发育推断及中接邻接网络分析均表明我国西南地区的裂头蚴种群可分为两个主要分枝。2.对我国东部、中部、南部和西南地区的裂头蚴分离株进行的系统发育分析及分化时间估算结果表明,我国的裂头蚴种群可以分为类群Ⅰ和类群Ⅱ两个主要类群,且这两个类群在上新世中期开始分化。