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目的：构建重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-hRAMP1,转染兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察其转染率及hRAMP1的mRNA及蛋白表达。方法：质粒pOTB7-hRAMP1用EcoRI+XhoI双酶切后回收hRAMP1片段,亚克隆至pShuttle-EGFP-CMV中,得到重组穿梭质粒；I-CeuI+I-Sce1双酶切处理pShuttle-EGFP-CMV-hRAMP1,回收EGFP-CMV-EGFP-hRAMP 1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒；重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞,观察细胞出毒迹象并进行包装、收毒、冻融、扩增、再收毒并作毒种鉴定后以离心,透析方法纯化腺病毒进行滴度测定及检测。提取新鲜骨髓,体外分离、培养并鉴定MSCs。将带有hRAMP1和EGFP基因的腺病毒载体,感染第3代MSCs,荧光倒置显微镜下计算感染率。收集病毒感染后的MSCs行RT-PCR检测表明存在hRAMP1基因的mRNA表达,WesternBlot亦证实hRAMP1基因的蛋白表达。结果：构建的重组穿梭质pShuttle-EGFP-CMV-hRAMP1用EcoRI+XhoI双酶切,得到大小为0.8kbp (hRAMP1)和5.1kbp (pShuttle-EGFP-CMV)两个片段；重组腺病毒质粒pAdxsi-EGFP-CMV-hRAMP 1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段；重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用；重组腺病毒Ad-EGFP-hRAMP1 PCR鉴定可见164bp的阳性扩增条带；经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×1011PFU/ml.成功转染Ad-EGFP-hRAMP1的兔MSCs可表达绿色荧光,当MOI值为800,转染效率为80%。RT-PCR检测转染后的MSCs有hRAMP1基因mRNA表达;Wester-blot检测转染后的MSCs有bRAMP1蛋白表达。结论：(1)成功构建了携带增强型绿色荧光蛋白基因和hRAMP1基因的重组腺病毒载体；(2)MSCs是一种理想的基因载体细胞,可用于hRAMP1的基因治疗。