【摘 要】
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本研究利用基因重组表达技术构建了rLZ-8真核表达载体,电转化毕赤酵母Gs115后,筛选出稳定高效分泌表达的rLZ-8工程菌株,结合阳离子交换色谱和凝胶色谱技术纯化得到了纯度很高
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本研究利用基因重组表达技术构建了rLZ-8真核表达载体,电转化毕赤酵母Gs115后,筛选出稳定高效分泌表达的rLZ-8工程菌株,结合阳离子交换色谱和凝胶色谱技术纯化得到了纯度很高的rLZ-8。在体外实验中发现灵芝免疫调节蛋白可以直接杀伤人白血病肿瘤细胞,这种机制并非是之前研究人员推测的免疫调节的间接杀伤方式。通过激光扫描共聚焦显微镜等研究手段,研究发现rLZ-8可富集在细胞核上,并可以触发胞内钙池的释放,引起肿瘤细胞发生程序性死亡,推测rLZ-8触发NB4人急性早幼粒白血病细胞发生程序性死亡的位点是细胞核。本研究对rLZ-8进行了晶体培养,通过X-ray的方法得到了一套1.8(A|°)的数据,解析得到了rLZ-8的晶体结构,将之与同一家族氨基酸序列相近却不具有抗肿瘤活性的FIP-fve蛋白的晶体结构进行了比对,发现主要的不同在于两个方面:(1)rLZ-8形成二聚体时,与N端α螺旋相互作用的环状结构域;(2)C端的FNIII结构上有5个疏水性差异较大的氨基酸,它们可能会与肿瘤细胞表面过度卷曲的糖链结合。综合以上比对的结果,决定设计去掉N端α螺旋的蛋白突变体,可以使形成二聚体时的环状结构与α螺旋形成的结构域消失,并观察4个疏水性很强的氨基酸对抗肿瘤活性的影响,同时还可以研究对rLZ-8免疫调节功能很重要的二聚体结构是否也是其抗肿瘤活性的结构基础,实验结果表明这个蛋白突变体仍具有抗肿瘤活性。本实验的创新之处在于:1)发现了rLZ-8诱导NB4人急性早幼粒白血病细胞发生程序性细胞死亡;2)发现了rLZ-8的晶体结构;3)发现了rLZ-8在肿瘤细胞内的杀伤位点和其自身的抗肿瘤结构域。
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