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目前已经明确女性在绝经前心血管疾病的患病率和死亡率明显低于同年龄男性,而一旦进入绝经期则迅速增加,接近同年龄男性水平,迄今已知这种差异和变化主要和女性体内的雌激素水平变化有关。类似的现象在糖代谢疾病中也可以观察到。
对于雌激素和糖代谢的关系,早在20世纪40年代,就有研究人员在寻找治疗糖尿病的药物时,发现雌激素可能具有降低血糖的作用。但是在过去很长一段时间里糖尿病一直被列为雌激素使用的相对禁忌症,这主要是因为在一些临床工作中观察到育龄妇女服用口服避孕药后出现糖耐量下降,对绝经后女性进行激素替代治疗(hormone replacement treatment,HRT)会导致患者的糖耐量受损。后来发现口服避孕药和HRT对糖代谢的损害作用主要是孕激素导致的而不是雌激素引起的,相反正常生理水平的雌激素对糖代谢是存在有益作用的。目前最大的HRT群体研究——美国护士健康研究(Nurses Health Study,NHS)发现一直坚持服用雌激素的被观察对象糖尿病发生率明显低于未服用者和曾经服用者。在2001年美国糖尿病年会(American Diabetes Anniversary,ADA)上报告了心脏和雌/孕激素替代研究(the Heart and Estrogen Progestin Replacement Study,HERS)的结果:服用雌激素替代治疗组,新的糖尿病发生率降低36％。此外还有众多的临床和基础研究也提示雌激素对于糖代谢有改善的作用。但是一直以来也有部分研究提示雌激素对于糖代谢没有影响甚至可能存在不利的影响。由此可见,有必要对雌激素和糖代谢的关系进行深入的探讨,以期明确两者之间的关系。
近几年随着研究的不断深入,逐渐认识到糖尿病和高血压、冠心病等心血管疾病有着共同的发病基础--胰岛素抵抗。这就提示在预防和治疗这些疾病上有可能存在相同或类似的方法或手段。迄今不少实验研究和临床观察已经证实雌激素对心血管系统有确切的保护作用,并且已经对此达成共识。这就提示雌激素对于同样以胰岛素抵抗为发病基础的糖尿病可能也存在一定的保护作用。在目前糖尿病的发病率和患病率不断增加,业已成为世界公共卫生面临的巨大挑战的背景下,详细探讨雌激素对于糖代谢的影响以及产生这种影响的内在机制,将有助于更全面地了解糖代谢的调控,有可能为预防和治疗糖尿病提供一个新的视角和思路,具有非常重要的现实意义和社会价值。
正如前述对于雌激素和糖代谢之间的关系还没有完全确定,对于雌激素通过何种机制对糖代谢产生影响更是了解不多。新近一些研究提示细胞膜上的特殊结构——caveolae可能在雌激素对糖代谢产生作用的机制中发挥重要作用。Caveolae是1953年在细胞膜上观察到的一个特殊结构,其发挥生理功能的标志性蛋白被称为caveolin。caveolin已经证实有3个亚型,分别命名为caveolin-1、-2和-3。caveolin-1存在于大多数的细胞,以脂肪细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞为最多；caveolin-2的分布和caveolin-1类似,且常与之形成高分子量的异寡聚体；caveolin-3则主要在骨骼肌、心肌和平滑肌细胞,以骨骼肌细胞为最多。起初认为caveolae主要和细胞运输有关。现在发现许多信号分子集中或定位在caveolae上,并且和caveolin有着密切联系。这些信号分子包括Src家族酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体、Ras MAPK级联反应成员、NOs和酪氨酸激酶受体等,这就提示caveolae可能和信号转导密切相关。新近有资料提示caveolae及其特异蛋白caveolin在雌激素的信号转导途径中起着重要的作用。如:RazandiM等的研究发现,ER和caveolin相关并能调节其生成；Turi A等发现雌激素在子宫平滑肌能下调caveolae的数量和eaveolin蛋白水平；我室既往的研究发现提示caveolin-1介导雌激素抑制血管平滑肌细胞和内皮细胞增殖的作用,caveolae的结构完整是雌激素快速舒张血管效应的必须条件。由此可见caveolae、caveolin和雌激素的信号转导关系密切,值得深入研究。
在糖代谢方面,目前已经明确葡萄糖要进入细胞内需要葡萄糖转运蛋白(glucosetransporters,GLUTs)。在葡萄糖进入细胞并进行代谢的整个过程中GLUTS既是胰岛素信号转导产生生理作用的最后一步,又是将葡萄糖转运入细胞进行代谢的第一步和关键一步,因此GLUTs对于整体和细胞的糖代谢均起着举足轻重的作用。迄今已有三组共13种不同功能特性的GLUTs分子被克隆出来,其中最引起人们重视的是GLUT4,它在体内以接近最大速度转运葡萄糖,介导着骨骼肌、心脏和脂肪细胞这些重要的糖代谢器官组织的葡萄糖转运。研究发现骨骼肌中GLUT4表达增高会使得胰岛素的调节作用增强,有效降低糖尿病小鼠的血糖水平；靶向阻断骨骼肌细胞中GLUT4的表达,则表现为葡萄糖的基础转运水平下降和相应组织的胰岛素敏感性降低；采用基因敲除的方法构造GLUT4缺失的小鼠,可以观察到在大鼠骨骼肌对葡萄糖的摄入明显降低。因此目前许多在蛋白水平关于葡萄糖代谢和胰岛素信号转导的研究多集中在GLUT4。已有资料显示caveolae、caveolin和GLUT4关系密切,如Scherer等在3T3L1细胞上发现caveolin-1和GLUT4可能位于相同的细胞小囊中；Karlsson的研究显示大部分GLUT4和caveolin-1共定位,85％的GLUT4定位在caveolae上。
由上述分析可见,caveolae、caveolin既可能在雌激素的信号转导中发挥重要的作用,又和糖代谢关系密切。这就提示caveolae、caveolin可能在雌激素对糖代谢的影响中起着一定的作用,雌激素可能是通过caveolae、caveolin的介导实现对糖代谢的影响。但是目前还没有针对这一问题进行相关研究。深入探讨这一问题将有助于我们对雌激素和胰岛素两种激素信号转导的认识,更好地了解这两种激素之间的相互作用以及对于糖代谢的影响。此外现有关于caveolae和糖代谢的研究多集中在脂肪细胞或其前体细胞——3T3L1细胞,对于在机体糖代谢起着重要作用的另外一种组织(细胞)——骨骼肌组织(细胞)则研究较少。但是肌肉组织特别是骨骼肌是机体在运动状态时消耗能量最大的组织/器官,在糖代谢起着举足轻重作用。所以研究肌肉组织特别是骨骼肌的糖代谢对于研究整体的糖代谢有着重要的意义。深入探讨caveolae在雌激素影响糖代谢机制中的作用将有助于更全面地了解糖代谢,从一个新的角度来探讨血糖异常的成因,有可能可以为研制调控血糖的药物提供一个新的方向。
基于上述理由,本研究选择骨骼肌作为研究对象,探讨雌激素对于糖代谢的影响作用,及其这种影响作用产生的内在机制,重点了解caveolae在其中所起着的作用。本课题共分三个部分。第一部分将从整体水平重点探讨雌激素对于大鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平和胰岛素敏感指数的影响,同时观察大鼠骨骼肌中eaveolin-3蛋白水平的变化。第二部分将用不同药物对骨骼肌细胞进行干预,接着测定骨骼肌细胞的葡萄糖消耗和葡萄糖转运,明确不同干预措施对于骨骼肌细胞糖消耗和糖转运的影响。第三部分采用免疫共沉淀的方法重点探讨ER、caveolin-3和GLUT4三种蛋白之间的相互作用关系,深入探讨雌激素对于糖代谢产生影响的可能内在机制。
本课题从一个新的角度来探讨影响糖代谢的可能途径,有助于进一步了解胰岛素信号转导、体内葡萄糖代谢及相关影响因素,有可能为预防和治疗糖尿病提供一个新的视角和思路,为研制抗糖尿病药物提供一个新的思考方向。
第一章雌激素对大鼠糖代谢和胰岛素敏感性的影响及骨骼肌中Caveolin-3的变化
在本研究的第一部分我们采用高脂高糖饲料喂养Wistar大鼠构造2型糖尿病模型,并皮下给予雌激素进行干预,观察雌激素对大鼠空腹血糖、空腹胰岛素水平和胰岛素敏感指数的影响,同时观察大鼠骨骼肌中caveolin-3蛋白水平的变化。
72只雌性Wistar大鼠,先予普通饲料喂养1周,待大鼠适应后,行去势手术或假手术,手术时一并取大鼠股四头肌肉进行分析caveolin-3含量。术后所有大鼠恢复一周,而后随机分为6组:①普通饲料,假手术组(S+C);②普通饲料,去势组(O+C)；③普通饲料,去势+雌激素替代治疗组(O+E+C)；④高脂高糖饲料,假手术组(S+FS)；⑤高脂高糖饲料,去势组(O+FS)；⑥高脂高糖饲料,去势+雌激素替代治疗组(O+E+FS)。①～⑨组给予常规饲料,④～⑥组给予高脂高糖饲料。根据分组进行喂养(记为0月):③和⑥组每天皮下注射17-β雌二醇20ug/kg(17-βE2溶于100ul的蓖麻油中),其余每天皮下注射蓖麻油20ug/kg。共喂养4个月。大鼠每月检测空腹血糖,空腹胰岛素,计算胰岛素敏感指数。第O月加测糖化血红蛋白(GHbAlc)。4个月后处死所有大鼠复查上述指标。
结果:
1.1不同组别之间的空腹血糖水平比较
六组大鼠在入组前(即0月时)空腹血糖水平无明显差异(p>0.05)。
普通饲料喂养的三组[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]中,任意一组的空腹血糖水平在整个研究期间均较0月无显著变化(p>0.05),三组彼此之间也无明显差异(p>0.05)。
高脂高糖饲料喂养的三组[即(S+FS),(O+FS)或(O+E+FS)]出现如下变化:(1)和自身入组前(即和自身0月)比较:第1个月血糖较0月略有下降但是没有统计学差异(p>0.05)；第2个月开始逐渐出现空腹血糖较0月升高但是没有显著差异(p>0.05)；第3、4个月空腹血糖较0月有显著性差异(p<0.05)；(2)和普通饲料喂养的三组[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]中任意一组比较:在第1个月,高脂高糖饲料喂养的任何一组和普通饲料喂养的任何一组相比,空腹血糖略有下降,但是没有统计学差异(p>0.05)；在第2个月高脂高糖饲料喂养的任何一组和普通饲料喂养的任何一组相比,空腹血糖略有升高,但是没有统计学差异(p>0.05)；在第3个月,高脂高糖饲料喂养的任何一组和普通饲料喂养的任何一组相比,空腹血糖均有升高,其中(O+FS)和普通饲料喂养的任何一组[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]相比,均有统计学差异(p<0.05),而(S+FS)或(O+E+FS)中的任何一组和普通饲料喂养[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]的任何一组相比则没有统计学差异(p>0.05)；在第4个月,高脂高糖饲料喂养的任何一组和普通饲料喂养的任何一组相比,空腹血糖均有显著升高,且均有统计学差异(p<0.05)。(3)高脂高糖饲料喂养的三组之间进行两两比较:(S+FS)和(O+E+FS)进行比较在整个研究期间,空腹血糖均无明显的差异(p>0.05)；(O+FS)和(S+FS)或(O+FS)和(O+E+FS)进行比较,(O+FS)在第1月无明显升高或减低,在第2个月和第3个月,(O+FS)有升高但是无统计学差异(p>0.05),(O+FS)在第4个月则有明显升高,且这种升高有显著性差异(p<0.05)。
1.2不同组别之间的空腹胰岛素水平比较
六组大鼠的空腹胰岛素水平在入组前(即0月时)无明显差异(p>0.05)。
普通饲料喂养的三组[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]中,任何一组的空腹胰岛素水平均在整个研究期间均较0月无显著变化(p>0.05),三组之间也无明显差异(p>0.05)。
高脂高糖饲料喂养的三组[即(S+FS),(O+FS)或(O+E+FS)]出现如下变化:(1)和自身入组前(即和自身0月)比较,空腹胰岛素水平持续上升,且从第2个月起即有显著性差异(p<0.05)；(2)和普通饲料喂养的三组[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]中任意一组比较,从第1个月起,即有升高,但是在第1和第2个月无显著性差异(p>0.05),在第3和第4个月有显著升高(p<0.05)；(3)在高脂高糖饲料喂养的三组之间进行两两比较,(O+FS)和(S+FS)或(O+FS)和(S+E+FS)进行比较,(O+FS)组的空腹胰岛素水平从第1个月起即较高,但是在第1和第2个月,这种差异无统计学意义(p>0.05),在第3和第4个月,则显示出显著性差异(p<0.05)。(S+FS)和(O+E+FS)比较,则在整个研究过程中未显示出差异(p>0.05)
1.3不同组别之间胰岛素敏感指数的比较
六组大鼠在入组前(即0月时)胰岛素敏感指数无明显差异(p>0.05)。
普通饲料喂养的三组[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]中,任意一组的胰岛素敏感指数在整个研究期间均较0月无显著变化(p>0.05),三组彼此之间也无明显差异(p>0.05)。
高脂高糖饲料喂养的三组[即(S+FS),(O+FS)或(O+E+FS)]出现如下变化:(1)和自身入组前(即和自身0月)比较,胰岛素敏感指数持续下降,至第2个月,(O+FS)组的胰岛素敏感指数明显低于自身0月的水平(p<0.05),第3和第4个月,则三组的胰岛素敏感指数均显著低于自身0月水平,且这种差异有统计学意义(p<0.05)；(2)和普通饲料喂养[即(S+C),(O+C)或(O+E+C)]中任意一组相比,高脂高糖饲料喂养的任意一组从第1个月起胰岛素敏感指数即低于普通饲料喂养的任意一组；在第2和第3个月,(O+FS)组和普通饲料喂养的任何一组之间的差异即有统计学差异(p<0.05),此时(S+FS)或(O+E+FS)中的任何一组和普通饲料喂养的任意一组相比差异还没有显著性(p>0.05)；在第4个月,高脂高糖饲料喂养的任意一组和普通饲料喂养的任意一组比较,均有显著性降低(p<0.05)；(3)高脂高糖饮食的三组之间进行两两比较,(O+FS)和(S+FS)或(O+FS)和(O+E+FS)相比胰岛素敏感指数降低,在第4个月这种差异显示出显著性差异(p<0.05),(S+FS)和(O+E+FS)相比,在整个研究期间未见有明显差异(p>0.05)。
1.4不同组别之间的糖化血红蛋白比较
六组大鼠的糖化血红蛋白在入组前(即0月时)无明显差异(p>0.05)。
喂养4个月后复查GHbAlc。六组之间也没有显著性差异(p>0.05)。
1.5不同组别之间骨骼肌中的Caveolin-3蛋白表达含量比较
以(S+C)组作为对照进行感光密度分析。
各组之间在基础水平无明显差异(p>0.05)。
经过4个月喂养,在普通饲料喂养的三组中,(O+C)或(O+E+C),Caveolin-3蛋白含量和(S+C)(即对照组)相比无明显差异(p>0.05)。在高脂高糖饮食喂养的三组[即(S+FS),(O+FS)或(O+E+FS)]中,任何一组和(S+C)组比较均有显著下降,且差异有统计学意义(p<0.05)。(S+FS),(O+FS)和(O+E+FS)三组之间进行两两比较:(O+FS)和(S+FS)或(O+FS)和(O+E+FS)比较,Caveolin-3蛋白含量明显下降,且有统计学差异(p<0.05)。(S+FS)和(O+E+FS)比较则无显著性差异(p>0.05)。
小结:
(1)雌激素能够降低高脂高糖饲料喂养大鼠的空腹血糖和空腹胰岛素,升高胰岛素敏感指数。
(2)大鼠中骨骼肌细胞上caveolin的变化情况和整体糖代谢的变化相似,提示两者可能存在一定的相关关系。
第二章雌激素对骨骼肌细胞糖消耗和糖转运的影响及Caveolin-3在其中的可能作用
本部分我们培养骨骼肌细胞,先做出雌激素的剂量效应关系,接着做雌激素的时间效应关系,然后给予骨骼肌细胞以不同的干预,用放射同位素法检测骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运,了解雌激素、他莫昔芬(Tamoxifen)和β-MCD单独或联合使用对骨骼肌细胞糖代谢中糖转运和糖消耗的影响,探讨雌激素对骨骼肌细胞糖代谢的影响以及可能的机制,了解caveolae在其中的可能作用。
选取Wistar新生乳鼠培养骨骼肌细胞。用葡萄糖氧化酶法测定培养液中葡萄糖的残存量,计算出骨骼肌细胞的葡萄糖消耗量。用2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖法测定骨骼肌细胞的葡萄糖转运量。
雌激素的浓度效应关系:10-5～10-10mol/L的17β-雌二醇会使得骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运增加,以浓度为10-8mol/L时作用最明显。
雌激素的时间效应关系:10-8mol/L浓度的雌激素在(0min～48hr)对骨骼肌细胞糖消耗和糖转运有显著增强作用,这种作用在5min即可以观察到,在15min达高峰,至少可持续48小时。
对骨骼肌细胞进行分组实验,将培养的骨骼肌细胞分为6组,分别为:空白对照组(C)、雌激素处理组(E)、雌激素+他莫昔芬组(E+Ta)、雌激素+β-MCD组(E+β)、他莫昔芬处理组(Ta)、β-MCD处理组(β)。发现E组较C组,骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运(3200±280 vs1000±100,4300±360 vs1000±100)均明显增加(p<0.05)；(E+Ta)组骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运较C(1800±150 vs1000±100,2100±180 vs1000±100)增加(p<0.05),与E组比较(1800±150 vs3200±280,2100±180 vs4300±360)则明显下降(p<0.05)；(E+β)组骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运较C组(2000±200 vs1000±100,2200±210 vs1000±100)增加(p<0.05),与E组比较(2000±200 vs3200±280,2200±210 vs4300±360)则明显下降(p<0.05)；Ta组骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运与空白对照组相比(1000±150 vs1000±100,980±100 VS1000±100)无明显变化(p>0.05),β组骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运较C组(600±100 vs100±1000,700±120 Vs1000±100)明显减弱(p<0.05)。
小结:
(1)雌激素在浓度为10-5mol/L～10-10mol/L能显著增加骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运,其中接近生理剂量时(10-8mol/L)效果最明显。雌激素的这种效应可以被他莫昔芬或β-MCD阻断。
(2)雌激素改善骨骼肌细胞糖代谢的作用可能是通过细胞膜上的caveolae来实现的,也必须有雌激素受体的参与。
第三章雌激素受体、葡萄糖转运蛋白-4和Caveolin-3在骨骼肌细胞中的关系
在本部分采用免疫共沉淀的方法,了解ER、GLUT4和caveolin-3之间的关系,从而探讨雌激素对于糖代谢影响的可能机制以及caveolae在其中的作用。
选取Wistar新生乳鼠培养骨骼肌细胞,对ER、GLUT4和caveolin-3两两进行免疫共沉淀。结果显示在骨骼肌细胞中GLUT4和caveolin-3免疫共沉淀呈阳性,ER和caveolin-3以及ER和GLUT4均呈阴性。
小结:
(1)雌激素对于骨骼肌细胞糖代谢的影响可能是通过和受体结合的非基因途径,在这条非基因途径上,caveolin可能起着一定的作用；
(2)在骨骼肌细胞GLUT-4可能位于或富集于细胞膜表面的caveolae。
(3)ER和GLUT4可能不存在直接的连接或作用。
结论:
(1)接近生理剂量的雌激素能够降低高脂高糖饲料喂养大鼠的空腹血糖、空腹胰岛素,升高胰岛素敏感指数。
(2)雌激素对于大鼠糖代谢的改善作用是通过增加大鼠骨骼肌细胞的糖消耗和糖转运而实现的,他莫昔芬和β-MCD均可以有效阻断雌激素对于骨骼肌细胞糖消耗和糖转运的这种增强作用。
(3)雌激素增加骨骼肌细胞糖消耗和糖转运的这种效应可能是一种需要雌激素受体参与的,和caveolin相关的非基因途径。这种效应是在caveolin的介导下通过富集于caveolae的GLUT4而实现。