论文部分内容阅读
癌症是威胁人类健康的重大疾病之一，全球各国政府部门和科研机构已投入大量的人力、物力和财力进行研制抗肿瘤药物、研究肿瘤发生发展机制和临床治疗技术等，并已获得大量显著的研究成果：尤其在抗肿瘤药物方面，已开发出多种高效抗肿瘤的新药物，并成功用于临床治疗。目前，现有的抗肿瘤药物还存在毒性强、疗效低和副作用大等缺陷。研制抗肿瘤新药仍然是药学领域的热点和具有挑战性的重大课题之一。纳米药物是刚刚兴起不久的新兴药物，由于其在提高药物稳定性、缓释、建立新的给药途径以及减少药物毒副作用方面的突出作用，应用前景广阔。铁蛋白是自然界中的一种分子结构极为特殊蛋白质，它不仅具有在pH3.0～10、70℃高温以及高盐等恶劣环境下不变性等特点，而且该蛋白还具有直径达可达10nm空腔结构，很适合用于构建纳米药物核-铁蛋白，起到纳米药物载体和输送药物的作用。
本文采用猪胰铁蛋白(PPF)为研究材料，首先采用透射电子显微镜、圆二色性(CD)光谱和荧光光谱探讨了在弱碱(pH)条件下，脱铁核猪胰铁蛋白(apoPPF)亚基解聚与重组的过程和规律。发现当反应介质的pH提升到13.0时，apoPPF迅速解离成游离的亚基；当中和反应介质时，已解离的亚基又能重新组装成铁蛋白。利用这一特性，构建了纳米顺铂核-猪胰铁蛋白(nanometerCDDP core-PPF，NCC-PPF)，并研究了其基本的理化性质，发现NCC-PPF的紫外光谱、CD光谱和电镜形态与apoPPF极为相似；但两者的荧光光谱有所差异，280nm激发下，其最大发射波长红移了约20nm。采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术分析，发现每分子apoPPF可储存11.26个顺铂分子，构成NCC-PPF。MTT、流式细胞术和蛋白质组学技术被应用于进一步检测NCC-PPF和CDDP对BGC823胃癌细胞凋亡的影响，以探讨这两种不同的给药途径诱导BGC823细胞凋亡的差异性和起因。MTT的实验结果指出：相同CDDP含量和相同且较短时间（如24h）内，NCC-PPF对胃癌的细胞毒性要低于游离的CDDP，其主要原因NCC-PPF具有缓释CDDP功能，在相同的作用时间内，NCC-PPF释放的CDDP数量较少。随着作用时间延长，NCC-PPF不断地释放已包装的CDDP，对胃癌细胞活性抑制率率逐渐升高。流式细胞术的实验结论也反应了类似的结果，随着时间的增加，流式检测到的NCC-PPF处理组凋亡细胞数量增加明显。同样说明包装在NCC-PPF的CDDP存在一个缓慢释放的过程，随着时间的增加，其诱导细胞凋亡的能力才逐步发挥出来。选用蛋白质组学及相关分析技术，筛选出NCC-PPF和CDDP诱导胃癌细胞凋亡过程中表达的19个差异蛋白，并采用肽质量指纹(PMF)图谱技术给予逐一鉴定。按生物功能进行划分，这些差异蛋白质参与了细胞凋亡调节、RNA转录、氧化应激、信号传导、细胞代谢、细胞骨架形成等过程。其中，以乳酸酰谷胱苷肽裂解酶，过氧化物还原酶2和肌动蛋白β亚基为代表的8个蛋白，表达趋势一致；而以磷酸甘油酸变位酶为代表的4个蛋白表达趋势不同。肿瘤细胞表达的多数差异蛋白趋势相同，少量蛋白存在差异，说明NCC-PPF和CDDP诱导胃癌细胞凋亡途径与主要机制很可能相同。选择Real-timePCR技术进一步验证这些差异蛋白质。总共12个被验证的差异蛋白中，有10符合度较好，说明差异蛋白的鉴定结果可信度较高。本研究为后续深入研究在体内NCC-PPF和CDDP诱导胃癌细胞凋亡分子机制，提供实验基础和科学依据，具有重要的科学意义和潜在的应用价值。