论文部分内容阅读
目的：通过体外实验检测γδT细胞的抗肿瘤活性及其负载Ki-67抗原肽后诱导特异性CTL的免疫杀伤作用，为肿瘤的免疫治疗提供重要的理论依据。 方法：1.从HLA-A2表达阳性的健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，用IL-2联合唑来膦酸刺激PBMC体外诱导扩增γδT细胞，流式检测诱导前后γδT细胞的比例;LDH释放实验及CFSE/PI双标法检测γδT细胞对人恶性黑色素瘤细胞株A375、人乳腺癌细胞株MCF-7的体外抗肿瘤活性。2.采用免疫磁珠分选技术分离得到高纯度的CD8+T细胞及活化后的γδT细胞。3.采用标准固相肽合成法(SPSS)合成人Ki-67抗原肽[280-288(LQGETQ LLV)]及相应MAP4修饰肽段;采用反相高压液相色谱仪(RP-HPLC)分析其纯度;采用电喷雾谱(ESI_MS)测目标多肽分子量。4.Ki-67280-288抗原肽及其MAP4-Ki-67280-288肽分别负载活化的γδT细胞后，与CD8+T细胞共培养诱导产生特异性CTL，并以未负载肽段作为对照组。选取人结肠癌细胞SW620(Ki-67+，HLA-A2+)、人乳腺癌细胞MDA-MB-231(Ki-67+，HLA-A2-)及人肾近曲小管上皮细胞HK-2(Ki-67-，HLA-A2+)作为靶细胞，利用LDH释放实验观察不同组效应细胞对上述靶细胞的体外杀伤效应;采用ELISA技术测定上述三组效应细胞IFN-γ的释放情况。 结果：1.IL-2联合唑来膦酸刺激PBMC第10天，γδT细胞的比例最高可达85.3％。2.LDH释放实验表明，活化后γδT细胞随着效靶比的增大对靶细胞的杀伤率逐渐增高，在效靶比为40∶1时，对于A375、MCF-7细胞株的杀伤率分别为42.8％±2.98％、36.1％±2.59％;CFSE/PI双标法结果显示活化后γδT细胞对于MCF-7细胞株的特异性细胞毒百分率随着效靶比的增大亦逐渐增高，且在效靶比为40∶1时，可达33.29％。3.合成的Ki-67280-288抗原肽及其MAP4-Ki-67280-288的纯度均在95％以上，符合实验标准;合成肽的分子量实测值与理论值之间无显著差异，表明所合成的肽是我们需要的目的肽段。4.Ki-67特异性CTL对于SW620细胞株(Ki-67+，HLA-A2+)具有明显杀伤效应，其杀伤率显著高于未负载肽段对照组(P＜0.05），且MAP4-Ki-67280-288诱导的杀伤效应明显高于Ki-67280-288抗原肽诱导的杀伤效应(P＜0.05）;但对MDA-MB-231细胞株(Ki-67+，HLA-A2)和HK-2细胞株(Ki-67-，HLA-A2+)杀伤效应明显减弱(P＜0.05）。5.上述三种效应细胞中，Ki-67280-288抗原肽及其MAP4-Ki-67280-288肽组诱导的CTL产生的IFN-γ的水平显著高于未负载肽段组，且MAP4-Ki-67280-288组明显高于Ki-67280-288抗原肽组（P＜0.05）。 结论：1.在体外实验中，经唑来膦酸诱导活化后的γδT细胞本身具有一定的抗肿瘤活性。2.γδT细胞负载HLA-A2限制性CTL表位肽Ki-67280-288后，在体外能够活化产生Ki-67特异性的细胞免疫反应，对HLA-A2和Ki-67均阳性的细胞株有更强的杀伤作用。3.MAP4修饰肽段能激发较相应单肽更强的特异性抗肿瘤效应，为γδT细胞疫苗的临床应用提供了理论和实验依据。