论文部分内容阅读
21世纪以来,H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)的大流行对全球的人类健康和公共安全造成巨大的威胁,引起人们极大的恐慌,同时也给全球经济带来严重损失,我国在该疾病的防控和研究中投入了不少成本和精力。本课题验证了前人蛋白组的部分结果,深入探究了热休克蛋白27(HSP27)在病毒感染过程中的作用,发现HSP27与流感病毒核衣壳蛋白(NP)的互作关系。通过截短表达蛋白显示HSP27与NP的C端互作,说明HSP27在一定程度上是通过影响H5N1 HPAIV的聚合酶活力来控制病毒的增殖和细胞的死亡,拓展了现有的流感病毒与宿主因子互作的网络,为以后对该病毒的防控提供新的思路和方向。主要研究成果如下:1鉴定出A549细胞感染H5N1 HPAIV rNS1-wt后,HSP27在不同时间点的表达情况在 H5N1 HPAIV rNS1-wt 感染 A549 细胞后的 4h、8h、18h、24h、30h 和 42h收集蛋白,通过Western blotting鉴定内源性HSP27的表达情况,结果证实在感染早期HSP27的表达上调,24h后蛋白表达下调。2发现H5N1 HPAIV rNS1-wt感染A549细胞后,HSP27对病毒增殖具有促进作用,同时证实HSP27对VSV-GFP和H5N1 HPAIV rNA-wt也具有促进作用成功克隆人源HSP27基因并将该基因连接到真核表达载体上,构建HSP27真核表达质粒,经Western blotting鉴定,HSP27实现过表达。与此同时,设计专门针对HSP27的siRNA,也能够有效沉默该基因。在细胞内瞬时过表达或沉默HSP27,发现HSP27的过表达能促进病毒的增殖;沉默则抑制病毒的增殖。不仅如此,HSP27对VSV-GFP和H5N1 HPAIV rNA-wt也具有同样的作用。3找到与HSP27互作的流感病毒蛋白通过Co-IP实验发现HSP27与流感病毒的NP蛋白互作,而对两种蛋白的不断截短发现NP与HSP27互作的区域位于蛋白的C端,不依赖NP的RNAbinding domain。4证实HSP27对病毒的促进作用依赖其磷酸化利用抑制剂阻断HSP27的磷酸化通路,使HSP27关键的磷酸化位点不能磷酸化,发现如果HSP27不能正常磷酸化,细胞在病毒刺激下很快死亡,病毒无法更好地增殖,病毒滴度很低。5鉴定出不同HSP27形式对病毒聚合酶活力的影响通过聚合酶活力实验证实不同HSP27形式对病毒的聚合酶活力的影响不同:HSP27全长能明显抑制流感病毒的聚合酶活力;如果HSP27被截短,那么这种抑制能力受到削弱;HSP27不能正常磷酸化也会相应削弱其对聚合酶活力的抑制作用,其中82位丝氨酸具有一定的主导作用。