论文部分内容阅读
研究背景肿瘤标志物在临床上已应用了许多年，对肿瘤的早期诊断及后续疗效观察起了重要作用。但传统的肿瘤标记物特异性不高，在某些良性非肿瘤疾病也会引起假阳性。此外，大部分肿瘤标记物只局限于某一种或几种特定组织类型的肿瘤而不能广泛作用于不同组织类型的肿瘤。为了提高检查准确性及全面性，临床上常将多种标志物组成联合标志物组，对不同组织类型的肿瘤应用不同的联合标志物组进行检测，作为筛查手段经济投入大，不符合成本-效益原则。研究发现PEG-3（progression elevated gene-3）是一种针对广泛肿瘤特征的启动子，能特异性识别多种恶性肿瘤细胞，而不对正常细胞产生影响，具有很好的靶向性。国内外关于PEG-3介导外源性基因表达的研究大多采用病毒载体。虽然能使基因高水平导入和表达，但所引发的宿主炎性免疫反应较强，生产成本亦甚高，最重要的是病毒载体具有潜在危险性。研究表明,通过“菌感”的方法可安全有效地利用细菌介导外源性基因进入细胞。即把侵袭素（Inv）与溶血素（hly）基因结合,就能使不具备侵袭能力的细菌进入非吞噬哺乳动物细胞，并在细胞内表达所需之目的基因。这种“菌感”的方式已在大肠杆菌和金葡菌上进行过试验,乳链菌被认为是一种对人体无害（generally regarded as safe, GRAS）的食品级的细菌，是作为“菌感”菌的最佳选择。但传统的乳链菌载体以红霉素或氯霉素等抗性基因作为选择标志，存在使抗生素抗性播散的危险。使用不带有抗性标记的thyA营养缺陷型细菌，具有更高的生物安全性。肠道有一定浓度的胸腺嘧啶核苷酸, thyA缺陷乳链菌能定植于肠道发挥作用。但thyA缺陷株不能在外界环境中生长，从而避免了包括“菌感”基因、抗性基因在内的外源基因发生水平转移的危险。如果我们将跨界重组thyA缺陷型乳链菌与肿瘤特异性标记系统相结合，就能使“菌感”菌侵入哺乳动物细胞，在肿瘤细胞表达和分泌绿色荧光蛋白，实现肿瘤的靶向标记。可视化和量化肿瘤细胞，不仅有助于检测肿瘤，还可用于术前分级，术中处理及术后监测。此外，还为将来进行基因靶向治疗奠定基础，具有广阔的应用前景。研究目的1.利用乳链菌穿梭质粒pTRKH2构建PEG-3启动子介导的肿瘤特异性标记系统，并验证其肿瘤特异性标记能力。2.根据细菌thyA营养缺陷型和双交叉同源重组的原理，构建一个含thyA基因的上、下游同源臂、inv基因及hly基因的同源重组质粒。通过感染试验初步证实了其“菌感”能力，为下一步构建thyA缺陷型跨界乳链菌肿瘤特异性标记系统奠定基础。研究内容本研究的内容主要分为两部分：一.肿瘤特异性标记系统的构建及其鉴定方法我们采用体外基因拼装（gene assembly）的方法得到PEG-3启动子，经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后利用基因克隆技术，将PEG-3启动子、egfp、poly A亚克隆到乳链菌-大肠杆菌穿梭载体pTRKH2的多克隆位点中，成功得到肿瘤特异标记质粒pTR-peg3-egfp。最后，我们用pTR-peg3-egfp分别转染肿瘤及非肿瘤细胞初步验证其肿瘤特异性标记能力。结果通过PCR基因拼装得到460bp左右肿瘤特异性启动子DNA序列，其测序结果与设计序列完全一致。获得了肿瘤特异标记的乳链菌穿梭质粒pTR-peg3-egfp，并在细胞水平得到初步验证。结论PEG-3启动子介导的乳链菌穿梭质粒具有肿瘤特异性，为进一步研究乳链菌疫苗应用于肿瘤标记及靶向治疗奠定基础。二.跨界乳链菌同源重组载体的构建及初步验证方法通过in-fusion技术，将inv克隆至温度依赖型乳链菌质粒pVE6007中，得到pVE-inv质粒，并送测序。将thyA-up、hly、thyA-down序列按所设计的酶切位点依次克隆入质粒pVE-inv中，构建同源重组质粒pVE-inv-hly。长出的单菌落先行PCR筛选出阳性克隆，再经酶切鉴定。分别用带pVE-inv-hly质粒的乳链菌和带pVE6007质粒（不含inv、hly）的乳链菌对肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549进行感染试验初步验证其菌感能力。结果测序表明，经过in-fusion克隆的inv序列与目的序列一致。酶切鉴定结果显示，成功构建出约9600kb含thyA基因的上、下游同源序列、inv基因及hly基因的同源重组质粒pVE-inv-hly。带pVE-inv-hly质粒的乳链菌进行感染试验有菌落生长，而带pVE6007质粒的乳链菌则没有菌落生长。结论成功构建同源重组质粒pVE-inv-hly，并证实了其菌感能力，为下一步利用ThyA缺陷型跨界乳链菌构建肿瘤特异性标记系统奠定基础。