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第一部分 体外心脏震波刺激后EPCs-exo的提取、鉴定及高通量测序[目 的]建立体外心脏震波刺激大鼠骨髓来源内皮祖细胞模型,提取外泌体并明确外泌体中相关miRNA的表达水平。[方 法]分离、诱导培养、鉴定大鼠骨髓来源内皮祖细胞,将内皮祖细胞分为两组:①对照组（CON组）:正常培养不予震波处理;②震波组（SW组）:予体外心脏震波（ECSW）500击,能量0.09mJ/mm2。从细胞上清液中提取两组外泌体（CON-exo和SW-exo）并予以鉴定。高通量测序筛查两组外泌体中差异表达的miRNAs,进行差异miRNA靶基因预测及功能显著性富集分析。提取两组EPCs和外泌体内总miRNA,对筛选出的miRNA进行qRT-PCR验证,明确目的miRNA的表达水平。[结 果]1.经密度梯度离心法获得大鼠骨髓源性内皮祖细胞,第3-4天细胞开始贴壁,呈卵圆形、多边形改变,第7天,细胞数量增多,呈集落式生长,14天内出现的典型“铺路石”样的细胞集落,21天细胞且呈长梭形改变。流式细胞术检测发现培养细胞表面可表达CD31,CD34,CD133和VEGFR-2,几乎不表达CD14和CD45。功能鉴定实验显示细胞可摄取DiI-ac-LDL及结合FITC-UEA-I,在基质胶表面形成毛细血管样结构。2.从EPCs细胞上清液中提取外泌体进行鉴定,透射电镜显示外泌体有双层膜,形态完整,大小均一,呈球形或杯状结构;粒径分析显示外泌体的直径在50-120 nm,颗粒浓度约7×10^8 particles/ml;Western blot结果显示外泌体表达特异性表面标记蛋白CD9、CD63和CD81,但不表达Calnexin。3.高通量测序结果显示SW-exo与CON-exo的miRNA表达谱基本重叠,显著分析（Foldchange＞2,p＜0.05）发现,有18个相对表达量较高的miRNA存在表达差异。与CON-exo 比较,SW-exo内mo-miR-140-3p表达显著上调（p＜0.01）。GO和KEGG富集分析发现,差异miRNAs预测靶基因可能涉及多条心肌缺血再灌注损伤相关通路的调控,如PI3K/AKT、MAPK、Apoptosis、NF-κB、HIF-1α、Ras等,与细胞增殖、生长、存活、凋亡等生物过程密切相关。经qRT-PCR验证,体外心脏震波刺激后无论是内皮祖细胞还是外泌体中miR-140-3p的相对表达量均明显高于对照组（p＜0.05）,显示与测序结果一致。[结 论]1.成功获得大鼠骨髓来源EPCs并建立体外心脏震波刺激EPCs模型。2.体外心脏震波刺激对内皮祖细胞外泌体内miRNA具有调节作用,经震波刺激后EPCs-exo内miR-140-3p表达水平明显升高。第二部分 体外心脏震波通过EPCs-exo/miR-140-3p/PTEN减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤[目 的]建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,从体外实验探讨体外心脏震波处理EPCs-exo对缺氧/复氧损伤后心肌细胞的保护作用和效应机制。[方 法]将PKH26标记的EPCs-exo与H9c2心肌细胞共孵育,验证心肌细胞对外泌体的摄取能力。建立H9c2细胞缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤模型,使用不同浓度的EPCs-exo干预H/R损伤后心肌细胞,确定外泌体干预的最佳浓度。分别将CON-exo和SW-exo与H/R损伤后的心肌细胞共孵育24h,实验分为 5 组:NC 组,H/R 组,H/R+PBS 组、H/R+CON-exo 组和 H/R+SW-exo组。为进一步探讨SW-exo中miR-140-3p的作用,将细胞分为5组:H/R组,H/R+miR-140-3p mimic NC 组,H/R+miR-140-3p mimic 组,H/R+miR-140-3p inhibitor NC+SW-exo 组和 H/R+miR-140-3p inhibitor+SW-exo 组。各组处理结束后,采用CCK-8法、LDH法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,活性氧检测细胞氧化应激水平,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3及炎症因子NF-κB的表达情况。此外,在上述所有分组中利用Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白及其磷酸化形式的表达变化,采用qRT-PCR检测细胞内miR-140-3p和PTEN mRNA的表达水平。采用双荧光素酶报告基因系统和细胞转染技术研究miR-140-3p对预测靶基因PTEN的调控作用。[结 果]1.外泌体示踪实验结果显示PKH26标记EPCs-exo与H9c2心肌细胞共孵育后心肌细胞内出现点状红色荧光信号,证实心肌细胞可摄取EPCs-exo。2.外泌体浓度筛选实验显示SW-exo和CON-exo可改善细胞活力,且呈现一个剂量依赖性,当外泌体浓度达到20μg/ml时作用最为显著（p＜0.01）,因此选择20μg/ml作为最佳干预浓度,用于后续实验。3.与NC组相比,H/R组的细胞活力显著下降,LDH活性、细胞凋亡率和细胞内ROS生成均明显上调,蛋白Bax、Cleaved caspase-3、NF-κB表达增加,Bcl-2 表达减少（p＜0.05）。与 H/R+PBS 组、H/R+CON-exo 组比较,H/R+SW-exo组细胞活力明显改善,LDH活性、细胞凋亡率和细胞内ROS生成显著下降,蛋白 Bax、Cleaved caspase-3、NF-κB 表达减少,Bcl-2 表达增加（p＜0.05）。4.与 H/R+miR-140-3p mimic NC 组比较,H/R+miR-140-3p mimic 组的细胞活力增加,LDH活性、细胞凋亡率、细胞内ROS生成均明显降低,蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、NF-κB 表达减少,Bcl-2 表达增加（p＜0.05）。H/R+miR-140-3p inhibitor NC+SW-exo 组与 H/R+miR-140-3pmimic 组的结果一致,差异无统计学意义（p＞0.05）,但miR-140-3p inhibitor可逆转SW-exo的上述保护效应,导致细胞活力下降,LDH活性、细胞凋亡率和细胞ROS生成增加,蛋白Bax、Cleaved caspase-3、NF-κB 表达升高,Bcl-2 表达下调（p＜0.05）。5.Western blot和qRT-PCR结果表明,与NC组比较,H/R组细胞内miR-140-3p表达量减少,PTEN的表达量增高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT磷酸化水平下降（p＜0.01）。与 H/R+PBS 组、H/R+CON-exo 组比较,H/R+SW-exo 组细胞内miR-140-3p表达量增加,PTEN的表达量减少,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT磷酸化水平提高（p＜0.05）。H/R损伤后H9c2细胞内转染miR-140-3p mimic可显著上调 miR-140-3p 水平,抑制 PTEN 表达,促进 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT磷酸化增加（p＜0.01）。miR-140-3p inhibitor 可明显抑制 SW-exo 对 miR-140-3p的上调效应,导致细胞内miR-140-3p表达减少,PTEN表达增加,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT磷酸化水平下降（p＜0.05）。6.双荧光素酶报告基因检测结果发现PTEN是miR-140-3p的靶基因,共转染PTEN 3’UTR-WT（野生型）和miR-140-3p mimic时报告基因的荧光强度显著下降（p＜0.01）,但共转染 PTEN3,UTR-MUT（突变型）和 miR-140-3p mimic 时,报告基因的荧光强度无明显变化（p＞0.05）。[结 论]1.EPCs-exo可被H9c2心肌细胞摄取利用,体外心脏震波刺激后EPCs-exo能够提高细胞活力,抑制细胞凋亡,下调炎症因子和氧化应激水平,减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。2.H/R损伤后H9c2细胞miR-140-3p的表达水平下调,SW-exo可能通过传递miR-140-3p至心肌细胞,抑制靶基因PTEN表达,激活PI3K/AKT通路,实现上述心脏保护效应。第三部分 体外心脏震波通过EPCs-exo/miR-140-3p/PTEN对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[目 的]构建ApoE基因敲除大鼠心肌缺血再灌注模型,从体内水平探讨体外心脏震波处理EPCs-exo对心肌缺血再灌注损伤的保护作用和效应机制。[方 法]利用基因编辑技术CRISPR/Cas9获得ApoE基因敲除大鼠,用于构建大鼠心肌缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）模型,短暂结扎大鼠冠状动脉左前降支,缺血45min后解开结扎线开始复灌,复灌后予以心肌注射外泌体或PBS液。将PKH26标记EPCs-exo进行心肌点注射,验证在体条件下心肌组织对EPCs-exo的摄取能力。将大鼠随机分为4组:假手术组（Sham组）、I/R+PBS组、I/R+CON-exo组和I/R+SW-exo组。为进一步在体内验证SW-exo内miR-140-3p的作用,我们在原有外泌体的基础上制备SW-exoinhibitor和SW-exoinhibitorNC,即震波前转染 miR-140-3p inhibitor 和 miR-140-3p inhibitor NC 至 EPCs,再提取其外泌体,利用qRT-PCR验证两组外泌体内miR-140-3p水平。将大鼠随机分为3组:I/R+PBS 组,I/R+SW-exoinhibitorNC 组,I/R+SW-exoinhibitor组。各组处理结束后,采用超声心动图检测大鼠心功能、心脏组织切片HE染色、Masson染色评估心肌组织结构损伤和纤维化情况,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3,炎症因子NF-κB和氧化应激因子NOX2的表达情况。此外,在上述所有分组中利用Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白及其磷酸化形式的表达变化;采用qRT-PCR检测心肌组织中miR-140-3p和PTEN mRNA的表达水平。[结 果]1.成功构建ApoE基因敲除大鼠模型,配繁后进行PCR和测序鉴定,获得ApoE基因双敲除（ApoE-/-）大鼠,用于动物实验造模。2.利用短暂结扎冠脉左前降支再恢复冠脉血流的方法成功建立大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型,结扎冠动脉左前降支后,观察到结扎部位以下心脏颜色变白,心电图提示ST-T抬高,解开结扎线后,心肌组织变为暗红色,心电图显示ST段逐渐回落。3.体内外泌体示踪实验中观察到心肌组织内可见点状PKH26红色荧光信号分布,与心肌细胞纤维重合,说明心肌组织能够摄取利用EPCs-exo。4.qRT-PCR 结果显示与 SW-exoinhibitorNC 比较,SW-exoinhibitor 中 miR-140-3p 水平明显降低（p＜0.01）,说明成功构建敲低miR-140-3p的SW-exo,可用于后续实验。5.与Sham组相比,I/R后大鼠左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）、左室舒张末期容积（EDV）、左室收缩末期容积（ESV）增高,左心室射血分数（EF%）和左室短轴缩短率（FS%）降低（p＜0.05）,与I/R+CON-exo 比较,SW-exo对大鼠EF%和FS%的改善作用更为显著（p＜0.05）。病理学结果显示CON-exo和SW-exo组心肌组织损伤减轻,周围炎性细胞浸润减少,心肌组织内胶原纤维显色减少,SW-exo组的作用更明显。与CON-exo 比较,SW-exo可显著下调心肌组织中TUNEL 阳性细胞率,抑制心肌细胞凋亡（p＜0.01）。与 I/R+PBS 组和 I/R+CON 组比较,SW-exo 可显著下调 Bax、Cleaved caspase-3、NF-κB、NOX2 表达,促进 Bcl-2 表达上调（p＜0.05）。6.与 I/R+SW-exoinhibitorNC 组比较,I/R+SW-exoinhibitor组 LVIDd、LVIDs、EDV、ESV升高,EF%和FS%降低,心功能下降（p＜0.05）,但与IR+PBS组比较,I/R+SW-exoinhibitor 组 EF%和 FS%仍有增高（p＜0.05）。SW-exoinhibitor NC 组与 SW-exo组心肌组织病理结果一致,但SW-exoinhibitor组心肌组织的损伤加重,胶原纤维显色增多,比I/R+PBS组的损伤程度稍轻。与I/R+SW-exoinhibitorNC组比较,I/R+SW-exoinhibitor组心肌组织中TUNEL 阳性细胞率增多,心肌细胞凋亡增加（p＜0.01）。与 I/R+SW-exoinhibitorNC 组相比,I/R+SW-exoinhibitor 组 Bax、Cleaved caspase-3、NF-κB和NOX2表达增加,Bcl-2表达下调（p＜0.01）。7.Western blot及qRT-PCR通路检测发现:与Sham组相比,I/R+PBS组心肌中miR-140-3p相对表达量减少,PTEN的表达增加（p＜0.01）。与I/R+PBS、I/R+CON-exo组比较,I/R+SW-exo组miR-140-3p表达上调,可抑制PTEN表达,促进PI3K/AKT磷酸化水平提高（p＜0.05）。与I/R+SW-exoinhibitor NC组相比,I/R+SW-exoinhibitor 组的 miR-140-3p 表达水平下调,PTEN 表达增加,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT磷酸化水平下降（p＜0.05）。[结 论]1.EPCs-exo可被心肌组织摄取利用,体外心脏震波刺激EPCs-exo可明显改善I/R大鼠心功能和心室重构,抑制心肌细胞凋亡,减轻炎症和氧化应激,改善大鼠心肌缺血再灌注损伤。2.SW-exo可能通过miR-140-3p/PTEN轴,激活PI3K/AKT通路,发挥心脏保护作用,miR-140-3p inhibitor可使PI3K/AKT蛋白的磷酸化受阻,从而拮抗SW-exo的大部分保护作用。