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1.研究背景和目的构建组织工程角膜作为角膜的等效物是解决角膜移植供体来源匮乏和术后排斥反应的有效途径。其研究内容包括四个方面:种子细胞、支架材料、构建细胞-支架复合体的方法和技术以及组织工程角膜的临床应用。其中能与生理角膜功能相匹配的理想的组织工程角膜支架材料至今尚未获得,现有的材料在细胞相容性、强度、降解率、免疫原性、透明性等方面都各自存在着缺点。为拓展组织工程角膜支架材料的来源,研制一种符合组织工程角膜要求的理想的支架材料,本课题选择了来源丰富,与人角膜同源性高的猪角膜,对其进行脱细胞处理,在降低其抗原性及病原性的同时,尽量保留天然角膜的组织结构(基底膜)以提高其细胞亲和性。对制备的脱细胞角膜基质进行组织学特征观察,并进行体内、体外实验以研究其细胞亲和性和免疫原性,观察其体内移植后的修复基质缺损的效果,探讨本课题选用的方法制备的脱细胞猪角膜基质能否作为较理想的组织工程角膜的支架材料。2.方法2.1 APCS-BM的制备及组织学特征观察取新鲜猪角膜,切取约1/2厚的前板层基质,2.5mM EDTA消化去除上皮细胞,反复快速冻融,随后DNA-RNA酶消化,进一步去除基质细胞,最后将材料冷冻干燥,钴60消毒,保存备用。取样本制作石蜡切片、常规HE染色,光镜观察制备的材料的组织学结构;另取样本在扫描电镜下观察材料的前弹力层面和中间基质面超微结构;免疫荧光法分别检测材料前弹力层面的层粘蛋白和IV胶原成分。2.2 APCS-BM细胞相容性的研究体外培养兔角膜上皮、基质细胞、人皮肤表皮细胞和真皮成纤维细胞,取第3代兔角膜上皮和基质细胞分别接种在APCS-BM的前弹力层面和中间的基质面,分别体外培养10天和5天后,取细胞-支架复合物制作石蜡切片,HE染色,光镜观察。另取第3代人真皮成纤维细胞接种在APCS-BM的中间基质面,培养3天后,将材料翻转,取第3代人皮肤表皮细胞接种在材料的前弹力层面上,培养10天后,取细胞-支架复合体制作石蜡切片,HE染色,光镜观察。2.3 APCS-BM免疫原性的研究将APCS-BM(实验组)和新鲜猪角膜基质(对照组)分别植入大鼠背部皮下,术后2周取材HE染色,光镜观察照相,同时取标本行冰冻切片,对标本中CD4阳性淋巴细胞进行免疫荧光计数,并行统计学分析。将APCS-BM(实验组)和新鲜猪角膜基质(对照组)分别植入大鼠角膜囊袋内,术后2周取材HE染色,光镜观察照相,同时取标本行冰冻切片,对标本中CD4阳性淋巴细胞进行免疫荧光计数,并行统计学分析。2.4 APCS-BM的板层移植修复兔角膜基质缺损将直径7.5mm的APCS(带基底膜面朝上)移植于直径7.0mm板层切除的兔角膜植床上,术后1、2、8月角膜取材进行HE染色,光镜观察和透射电镜观察。对照组行自体角膜移植。2.5复合皮肤成纤维细胞的TE角膜基质修复兔角膜基质缺损取兔耳部皮肤,行皮肤成纤维细胞的原代培养,取第3代细胞用PKH26荧光染料标记细胞后接种在APCS-BM支架材料上,体外培养5天后,将细胞-支架复合体进行自体兔眼移植。术后1、2、5月角膜取材进行HE染色,光镜观察、冰冻切片荧光显微镜观察。3.结果制备的脱细胞角膜基质大体看呈白色,上皮面微凸,复水后韧性增加,能耐受缝线的切割。HE切片见细胞完全脱尽,基质表面的前弹力层呈连续的红色带状结构,基质胶原结构呈疏松的网状,但无明显的断裂,保留了角膜胶原的束状有序的排列,免疫荧光染色见前基质表面层粘蛋白和IV胶原呈阳性表达,而相对的基质面则为阴性。扫描电镜显示材料靠近上皮面的细胞脱尽,前弹力层表面呈毛毡样外观,局部放大有沟、嵴及孔径不等的微孔样结构,而相对的基质面呈现出与前弹力层面完全不同的疏松的网状结构,未见细胞成分残留。体外细胞培养显示接种的细胞均可在APCS-BM上黏附生长。5天后,角膜基质细胞侵入支架内部,10天后,角膜上皮细胞在支架上形成了2-3层的复层化细胞,与支架表面接合紧密。人皮肤表皮细胞和真皮成纤维细胞在APCS-BM上的复合接种10天后,皮肤表皮细胞在APCS-BM表面形成4-5层的复层结构,真皮成纤维细胞在支架层间生长。APCS-BM在大鼠皮下移植,术后2周取材时2个组皮肤伤口均愈合,植片无排出。HE切片显示APCS-BM组植片周边及植片内部可见中性粒细胞、淋巴细胞等浸润,但明显少于新鲜猪角膜基质组。CD4阳性淋巴细胞的记数结果显示两组有显著性差异,APCS-BM组少于新鲜猪角膜基质组。APCS-BM在大鼠角膜原位移植,术后2周,2个组角膜伤口无裂开,植片无脱出,APCS-BM组角膜水肿轻于新鲜猪角膜基质组,APCS组角膜新生血管明显少于新鲜猪角膜基质组。HE切片显示APCS-BM组植片周边及植片内部可见中性粒细胞、淋巴细胞等浸润,但明显少于新鲜猪角膜基质组。CD4阳性淋巴细胞的记数结果显示两组有显著性差异,APCS-BM组少于新鲜猪角膜基质组。APCS-BM板层移植到基质缺损的兔眼后,角膜上皮于术后2周可完全覆盖APCS-BM表面,术后观察8个月,角膜上皮生长良好,荧光素染色阴性,角膜基质损伤修复,角膜逐步转透明,可见瞳孔。术后1个月,HE显示材料表面的角膜上皮与正常角膜上皮结构一致,透射电镜下角膜上皮表面可见微绒毛、细胞间桥粒、基底细胞与基底膜间的半桥粒结构。受体的基质细胞长入材料并分泌新生胶原。复合皮肤成纤维细胞的TE角膜基质移植到基质缺损的兔眼后,角膜上皮于术后10-12天可完全覆盖植片表面,术后观察5个月,角膜基质损伤修复,角膜转透明。术后1个月,HE显示材料表面的角膜上皮复层化,有过度增生表现,APCS内大量纤维样细胞,荧光显微镜下可见较多红色荧光阳性细胞存在,术后5个月,角膜上皮结构正常,基质内纤维细胞减少,荧光显微镜下仍可见红色荧光阳性细胞。4.结论本课题采用的EDTA酶消化,联合反复冻融及冷冻干燥法研制的脱细胞角膜基质—细胞成分被有效去除,前弹力层面保留了基底膜成分,中间基质层呈疏松的网状结构;有良好的细胞相容性,兔角膜上皮细胞、基质细胞、人皮肤表皮细胞和真皮成纤维细胞体外在APCS-BM的不同界面上生长良好;免疫原性低,大鼠体内原位和异位移植后引起的局部免疫反应明显轻于新鲜角膜基质;体内板层移植后能重建眼表,修复兔角膜基质缺损,与受体角膜整合并透明化;而APCS-BM复合皮肤成纤维细胞的TE角膜基质成功修复兔角膜基质缺损则提示来源于自体皮肤的间充质细胞有希望作为种子细胞来构建TE角膜基质。实验结果表明APCS-BM是一种较理想的组织工程角膜支架材料。