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研究背景:骨肉瘤(Ostesarcoma,OS)是儿童和青少年中较为常见的原发性肿瘤,转移较早。目前临床中主要采取手术和化疗的治疗方式,然而化疗药物的毒副作用和肿瘤耐药的发生严重影响了骨肉瘤的治疗效果。所以,寻找一种新型的治疗方案,旨在降低化疗药物的副作用以及肿瘤耐药的发生率是当下研究的热点。植物化学药物与传统化疗药物的结合是一种新兴的肿瘤治疗新策略,以提高抗肿瘤效果。顺铂(cis-diamminedioplatinum II,DDP)是一种常见而有效的化疗药物,已经作为临床的一线用药,用于多种肿瘤的治疗。辣椒碱(trans-8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide,CAP)是红辣椒的主要刺激性成分之一,我们前期的研究表明,辣椒碱对人骨肉瘤细胞具有较强的体外和体内抗增殖作用。所以,我们推测辣椒碱可以增强顺铂对于骨肉瘤的敏感性。目的:探讨联合使用低浓度的辣椒碱(CAP)与顺铂(DDP)对骨肉瘤(OS)细胞体外和体内的潜在抗癌机制。有鉴于此,本研究共分为四个部分:第一部分明确辣椒碱联合顺铂对骨肉瘤细胞活性的影响,判断二者是否具有协同作用;第二部分探讨辣椒碱联合顺铂对骨肉瘤细胞凋亡,增殖,侵袭和自噬的影响,并进行相关分子机制的研究;第三部分探讨活性氧(ROS)在联合用药中对凋亡和自噬的调控作用;第四部分在体内实验中论证联合用药对骨肉瘤裸鼠移植瘤的抑制作用。主要研究方法:1)采用CCK-8检测辣椒碱,顺铂和联合用药处理后细胞活性的变化;2)使用Calcusyn分析联合用药的协同指数(CI):CI<1为拮抗作用;CI>1为拮抗作用;CI=1为叠加作用;3)使用AV-FIFC/PI染色,通过流式技术检测联合用药处理后细胞凋亡的变化;4)使用JC-1试剂盒检测联合用药处理后线粒体膜电位(Δψm)的变化;5)采用PI染色流式细胞分析仪检测联合用药处理后细胞周期的分布;6)利用Transwell小室对联合用药处理后的骨肉瘤细胞体外侵袭性进行检测;7)通过明胶酶谱(Gelatin zymography assay)检测联合用药处理后金属蛋白酶MMP2和MMP9的活性;8)通过单丹磺酰尸胺染色(MDC)检测联合用药处理后自噬泡(autophagic vacuoles)的变化;9)通过透射电镜检测联合用药处理后自噬小体的形成情况;10)使用DCFH-DA探针检测联合用药处理后活性氧(ROS)的变化;11)通过Western blot检测联合用药处理后细胞凋亡,增殖,侵袭,自噬,活性氧和其相关分子机制的变化;12)裸鼠皮下成瘤检测联合用药体内对骨肉瘤裸鼠移植瘤的抑制作用;13)通过免疫组化检测Pcna和Ki67在骨肉瘤裸鼠移植瘤组织中的表达变化;主要研究结果如下:1.辣椒碱联合顺铂可以抑制骨肉瘤细胞的活性1.1.在3种骨肉瘤细胞系中(MG63,143B,HOS),发现不同低浓度的辣椒碱联合顺铂均可以促进抑制骨肉瘤细胞活性,差异具有统计学意义(P<0.05);1.2.计算不同低浓度的辣椒碱和顺铂的协同指数(CI),发现CI值多数均小于1,说明二者具有协同作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.辣椒碱联合顺铂促进骨肉瘤细胞的凋亡2.1.在3种骨肉瘤细胞系中(MG63,143B,HOS),通过流式检测(AV-FIFC/PI),发现联合用药可以显著促进骨肉瘤细胞的凋亡(P<0.05);2.2.通过Western blot检测凋亡相关蛋白发现,联合用药可以显著引起促凋亡蛋白(Cytochrome c,Cleaved caspase-3,Bax)表达的升高和抗凋亡蛋白(Bcl-2,Survivin)表达的降低(P<0.05);2.3.通过JC-1检测发现,联合用药可以显著促进骨肉瘤HOS线粒体膜电位(Δψm)的降低(P<0.05);3.辣椒碱联合顺铂可以显著抑制骨肉瘤细胞的增殖3.1.在3种骨肉瘤细胞系中(MG63,143B,HOS),通过流式分析发现,联合用药可以显著促进3种骨肉瘤细胞在G0/G1期发生周期阻滞(P<0.05);3.2.通过Western blot检测周期相关蛋白,发现联合用药可以使周期蛋白(Cyclin D1,Cyclin D3,Cdk2,Cdk4,Cdk6)表达显著降低,(P18,P21,P27)显著升高(P<0.05);4.辣椒碱联合顺铂显著抑制骨肉瘤的侵袭4.1.在3种骨肉瘤细胞系中(MG63,143B,HOS),通过Transwell实验发现,联合用药可以显著抑制3种骨肉瘤的侵袭(P<0.05);4.2.通过Western blot检测侵袭相关蛋白发现,联合用药可以显著降低MMP2和MMP9蛋白的表达(P<0.05);与此同时,在明胶酶谱(gelatin zymography assays)实验中我们发现,联合用药可以显著抑制金属蛋白酶MMP2和MMP9的活性(P<0.05);4.3.通过解剖观察和HE染色我们发现,不论单独使用辣椒碱和顺铂,还是联合用药,均未发现骨肉瘤裸鼠移植瘤模型肺转移的发生。5.辣椒碱联合顺铂引起保护性自噬5.1.在3种骨肉瘤细胞系中(MG63,143B,HOS),通过MDC发现,联合用药可以显著促进自噬泡的形成,通过TEM发现联合用药作用后的骨肉瘤细胞MG63中的自噬小体显著增多;5.2.通过Western blot检测发现,联合用药可以促进3种骨肉瘤细胞自噬相关蛋白(Beclin1,Atg3,Atg16,Atg5)升高,P62降低,LC3B-I向LC3B-II的转化率升高(P<0.05),自噬相关通路蛋白中p-Akt和p-Mtor表达显著降低(P<0.05);5.3.使用自噬抑制剂巴氟罗霉素(Baf-A1)抑制自噬后,再给予联合用药处理,通过CCK8发现,骨肉瘤HOS细胞活性显著降低(P<0.05),在流式Annexin V-FITC/PI双重染色中发现,细胞凋亡率升高(P<0.05),通过Western blot检测发现,促凋亡蛋白(cleaved caspase-3,Bax)表达显著升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低。6.辣椒碱联合顺铂可以通过活性氧(ROS)介导Akt/Mtor和Jnk信号通路促进细胞自噬和凋亡6.1.在3种骨肉瘤细胞系中(MG63,143B,HOS),使用DCFH-DA探针,通过荧光显微镜和流式技术检测发现,联合用药可以显著促进活性氧(ROS)的产生;6.2.使用活性氧抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理骨肉瘤HOS后,再给予联合用药,通过CCK-8检测发现,细胞活性升高(P<0.05);在流式Annexin V-FITC/PI双重染色中发现,细胞凋亡率降低(P<0.05);6.3.通过Western blot检测发现,使用活性氧抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理骨肉瘤HOS后,可以抑制联合用药引起的自噬的相关分子蛋白(Beclin-1,Lc3B-Ⅱ/Lc3B-Ⅰ)和促凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3,Bax)表达,促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达,并使ROS介导的自噬和凋亡相关分子机制(p-Akt,p-Mtor)的表达升高,p-Jnk表达降低(P<0.05)。7.辣椒碱联合顺铂在骨肉瘤裸鼠移植瘤中的抑制作用7.1.裸鼠成瘤模型中发现,联合用药组的裸鼠肿瘤明显减小,重量明显减轻;老鼠体重明显减轻;在HE的检测中发现,单独用药和联合用药均能表现出不同程度的坏死,其中联合用药的坏死最为显著;7.2.通过免疫组化(IHC)检测发现,联合用药组的Pcna和Ki67表达显著降低(P<0.05);7.3.在血液生化检查中发现,单独用药和联合用药组均未发现血肌酐和尿素氮发生变化(P>0.05);对老鼠的肾脏进行HE染色发现,不论在对照组,还是处理组均未发现肾小管坏死、单核浸润、肾小球坏死等组织病理学改变(P>0.05)。综上所述,本文主要结论如下:在体外实验中辣椒碱协同增强了骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性,并且在体内实验中辣椒碱联合顺铂对骨肉瘤生长的抑制作用比对照组和单独给药组更为显著。与此同时,我们还讨论了辣椒碱联合顺铂杀伤骨肉瘤的相关分子机制。目前的结果表明,辣椒碱可作为一种化疗佐剂用于骨肉瘤的治疗。