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第一部分雄芍汤有效部位的提取分离及含量测定目的建立雄芍汤的提取方法,以及其总提取物中粗多糖、总苷、总生物碱三个有效部位的分离和含量测定方法。方法以水煎煮法作为雄芍汤的提取方法。采用醇沉法,并结合Sevage法除蛋白,以分离粗多糖；采用水饱和正丁醇萃取法分离总苷；采用强酸型阳离子交换树脂法分离总生物碱。采用可见分光光度法测定雄芍汤粗多糖提取物中总多糖的含量,以及总苷提取物中人参总皂苷的含量,采用高效液相色谱法测定总苷提取物中芍药苷的含量,采用酸碱滴定法测定雄芍汤总生物碱提取物中总碱的含量。结果粗多糖提取物中总多糖含量为55.74%,平均回收率为98.23%,RSD为0.54%；总苷提取物中人参总皂苷的含量为63.54%,平均回收率为96.34%,RSD为0.61%；总苷提取物中芍药苷的含量为10.01%,平均回收率为99.67%,RSD为1.38%；总生物碱提取物中总碱的含量为79.42%,平均回收率为101.12%,RSD为3.37%。结论雄芍汤的提取分离方法简便易行,其粗多糖提取物、总生物碱提取物与总苷提取物的含量测定方法灵敏度高,重现性好,可用于雄芍汤有效部位的质量控制。第二部分雄芍汤及其有效部位抗模型大鼠肝纤维化的作用及机理研究目的采用二甲基亚硝胺(DMN)诱导大鼠肝纤维化模型,进行雄芍汤及其三个有效部位(粗多糖、总生物碱和总苷)抗DMN诱导模型大鼠肝纤维化的药效学观察及其作用机理研究,以初步阐明雄芍汤中发挥抗纤维化作用的物质基础,为雄芍汤的开发应用打下坚实的理论基础。方法将86只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组(以下简称为正常组)12只及造模组74只。除正常组外,其余大鼠均采用DMN腹腔注射法制备大鼠肝纤维化模型,按10mg/kg剂量注射1%DMN,隔日1次,每周3次,共4周,正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水。在造模期间,造模组大鼠死亡4只,用于判定模型制备情况处死4只。造模成功后,除正常组外,将造模组剩余的66只大鼠再随机分为6组,每组11只：模型对照组、扶正化瘀对照组、雄芍汤组、粗多糖组、总生物碱组、总苷组(以下分别简称为模型组、扶正组、雄芍组、多糖组、总碱组、总苷组)。分别以0.105g/ml的扶正化瘀溶液、1.610g/ml的雄芍汤药液、35.420mg/ml的雄芍汤粗多糖提取物溶液、0.196mg-ml的雄芍汤总生物碱提取物溶液以及25.725mg/ml的雄芍汤总苷提取物溶液,按0.5ml/100g体重给各治疗组大鼠灌胃,正常组与模型组灌服等量生理盐水,每日1次,疗程4周。实验过程中观察大鼠一般情况,药物干预4周后处死取材。肉眼观察大鼠新鲜肝脏；计算肝重指数和脾重指数；全自动生化分析仪检测血清肝功能指标ALT、AST、TIBL和ALB；放射免疫分析法检测血清肝纤维化标志物HA、LN、PCⅢ和CIV；黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活力,DTNB还原法检测血清GSH-PX活力,TBA法检测血清MDA含量；ELISA法检测血清MMP-13与TIMP-1含量；样本碱水解法检测肝组织中羟脯氨酸含量；HE染色与Masson染色观察肝组织病理学改变；免疫组化法检测肝组织CTGF、 PDGF-B、Col一I、α-SMA的表达；FQ-PCR检测肝组织TGF-β1mRNA表达； Western blotting检测肝组织Smad3、Smad7蛋白表达。结果1.扶正化瘀胶囊、雄芍汤、雄芍汤粗多糖及雄芍汤总苷均能改善肝纤维化大鼠的一般情况,而雄芍汤总生物碱不具有此作用；2.肝重指数与脾重指数：模型组肝重指数显著低于正常组,脾重指数显著高于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组肝重指数均显著升高,脾重指数均显著降低(P<0.01)；扶正组与雄芍组的肝重指数、脾重指数均无显著性差异,与这两组相比,各有效部位组肝重指数均显著降低,脾重指数均显著升高(P<0.05或P<0.01)。3.肝功能指标：模型组血清ALT、AST及TBIL均显著高于正常组,ALB显著低于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组ALT、AST、TBIL均显著降低,ALB均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与雄芍组比较,各有效部位组ALT、AST与TIBL均显著升高(P<0.01)。4.肝纤维化标志物：模型组血清HA、LN、PC Ⅲ及CIV均显著高于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组HA、LN、PC Ⅲ及CIV均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与雄芍组比较,除多糖组和总苷组的cIV与雄芍组无显著性差异外,多糖组、总碱组和总苷组的其余指标均显著升高(P<0.05或P<0.01)。5.血清SOD、GSH-PX及MDA：模型组血清SOD及GSH-PX均显著低于正常组,MDA高于正常组(P<0.01)；与模型组比较,扶正组、雄芍组和总碱组SOD及GSH-PX均显著升高(P<0.01),MDA均显著降低(P<0.05或P<0.01),多糖组、总苷组与模型组各组之间差异无显著性；与雄芍组比较,多糖组、总苷组与总碱组的SOD、GSH-PX均显著降低(P<0.05或P<0.01), MDA均显著升高(P<0.01)。6.血清MMP-13及TIMP-1:模型组血清MMP-13显著低于正常组,TIMP-1显著高于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除多糖组TIMP-1与模型组、总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组MMP-13均显著升高(P<0.05或P<0.01), TIMP-1均显著降低(P<0.01)；与雄芍组比较,多糖组与总碱组MMP-13均显著降低,TIMP-1均显著升高(P<0.05或P<0.01)。7.肝组织Hyp、肝纤维化程度：模型组Hyp、肝纤维化半定量计分均显著高于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组Hyp、肝纤维化半定量计分均显著降低(P<0.01)；扶正组与雄芍组无显著性差异,各有效部位组Hyp、肝纤维化半定量计分均显著高于扶正组及雄芍组(P<0.05或P<0.01)。8.免疫组化：模型组肝组织CTGF、PDGF-B、Col-I及α-SMA表达均显著高于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组CTGF、PDGF-B、Col-I及α-SMA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)；扶正组与雄芍组无显著性差异,除多糖组的α-SMA表达与扶正组、雄芍组各组之间差异无显著性外,各有效部位组的其余指标均显著高于扶正组及雄芍组(P<0.05或P<0.01)。9.TGF-β1mRNA、Smad3及Smad7蛋白表达：模型组肝组织TGF-β1mRNA、 Smad3蛋白表达均显著高于正常组,Smad7蛋白表达显著低于正常组(P<0.01)；与模型组比较,除总苷组Smad7、总碱组与模型组无显著性差异外,其余各治疗组TGF-β1mRNA、Smad3蛋白表达均显著降低,Smad7蛋白表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与雄芍组比较,多糖组的TGF-β1mRNA表达显著降低(P<0.05),总碱组与总苷组的Smad3蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论雄芍汤总生物碱不具有抗DMN诱导的大鼠肝纤维化的作用,而雄芍汤粗多糖与雄芍汤总苷均具有确切的改善或逆转DMN诱导的大鼠肝纤维化的疗效。雄芍汤的物质基础为：(1)总生物碱介导雄芍汤抗脂质过氧化损伤的作用；(2)总苷介导雄芍汤促进MMP-13生成,抑制TIMP-1生成,从而促进Ⅰ型胶原降解的作用,粗多糖的作用次之；(3)粗多糖介导雄芍汤下调TGF-β1、α-SMA及Smad3表达,上调Smad7表达,调节TGF-β-Smad通路的作用,总苷的作用次之；(4)粗多糖与总苷共同介导雄芍汤抑制促纤维化细胞因子CTGF与PDGF-B表达的作用。第三部分雄芍汤及其有效部位含药血清对人肝星状细胞LX-2增殖的影响目的观察雄芍汤及其有效部位含药血清对人肝星状细胞增殖的影响,探讨雄芍汤抑制HSC增殖的物质基础。方法MTT比色法检测雄芍汤及其有效部位含药血清对LX-2增殖的影响。结果与20%、10%同浓度正常组相比,除总碱组与正常组无显著性差异外,其余各治疗组均对LX-2细胞的增殖有抑制作用(P<0.01)；与20%同浓度雄芍组相比,总碱组、总苷组对LX-2细胞增殖的抑制率显著降低(P<0.05或P<0.01)；与10%同浓度雄芍组相比,各有效部位组对LX-2细胞增殖的抑制率均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论雄芍汤总生物碱不具有抑制HSC增殖的作用,而雄芍汤粗多糖与雄芍汤总苷均具有抑制HSC增殖的功效。雄芍汤粗多糖介导雄芍汤抑制HSC增殖的作用,总苷的作用次之。