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人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor ,hGM-CSF)是一造血刺激因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,提高机体免疫力,具有十分重要的临床应用价值,在国际生物技术制药市场上也占有重要的位置。家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为探讨在家蚕丝腺特异性表达hGM-CSF的可能性,以家蚕丝素轻链基因(fib-L)组序列为左(约1.2kb)、右(约0.5kb)同源臂,用丝素重链基因(fib-H)启动子控制hGM-CSF基因,家蚕肌动蛋白A3启动子控制GFP报告基因,构建了轻链基因打靶载体pSK-FibL-L-A3GFP-PH-GMCSF-LPA-FibL-R;通过精子介导法将该载体导入初产卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR和DNA杂交结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕;western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为22 kDa的hGM-CSF特异性条带;ELISA分析结果显示,hGM-CSF在转基因后部丝腺组织的表达水平为2 700 pg/g冻干粉。表明通过基因打靶可以将外源基因导入希望的家蚕基因组位点,并实现表达。缺失丝素轻链基因的第6外显子第30核苷酸下游区域不影响家蚕的吐丝结茧。为了能通过遗传分子来改造家蚕丝,本研究构建轻链基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R,以丝素蛋白轻链基因组终止密码TAA上游1.2 kb和TAA下游0.5 kb左右的片段为同源臂,将绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA序列克隆进二同源臂之间,使GFP基因的读码框与丝素蛋白轻链基因的读码框一致,转基因载体通过精子介导法将该载体导入初产卵,并结合分子生物学检测,获得了能吐绿色荧光丝的基因打靶蚕。有关结果为分子设计改变蚕丝的性状奠定了基础。另外,我们建立了非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系,我们将家蚕核型多角体病毒极早期基因(ie-1)启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表达盒克隆进pIZT/V5-His获重组pIZT-IE-hGM-CSF,该载体转染家蚕BmN细胞后,通过博莱霉素(zeocin)筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定,成功检测到ie-hGM-CSF,western blot分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的为22 kDa,ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2 814.7 pg/106个细胞。