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目的:根据我国空间发展规划，我国的空间站将于2022前后发射升空并投入稳定运行，载人登月计划也在论证之中。随着空间探索的深入，航天员在太空停留的时间将越来越长，空间作业的安全性成为了不可回避亟需解决的关键问题。作为对生命活动影响最为重要的两个空间环境因素，空间辐射和微重力对机体及细胞水平的效应已有不少报道，其中肿瘤发生是最为严重的后果之一，而辐射与微重力是否有协同效应还鲜有研究。本课题通过模拟空间辐射及微重力来处理人肺上皮细胞，并观察细胞表型的改变，探索在这一过程中上皮间充质转换(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)在其中发挥的作用，分析空间辐射与微重力在诱导EMT及恶性转化的过程中是否具有协同效应，同时从EMT的角度阐述这两个因素在空间环境诱导肿瘤发生中的机制。
方法:(1)采用永生化人肺上皮细胞(BEAS-2B)为研究对象，选取银河宇宙射线中丰度占比为14％的α粒子作为处理因素，α源为苏州大学放射医学与防护学院的镅-241放射源。为了模拟空间环境的长期低剂量暴露，设置三个多次照射组，剂量率为0.02Gy/次，总剂量同样为0.2Gy、0.4Gy、0.5Gy，对应照射次数为10次、20次、25次，均为每三天照射一次，同时传代一次;同时，设置0.2Gy、0.4Gy、0.5Gy三个单次照射剂量组，以及一个无辐射对照组进行对比实验;在多次照射模型构建的过程中单次照射组与对照组细胞同步传代培养，直至多次照射模型建立成功，7组细胞分别标记为Ctrl(对照组)，R1-02(单次照射0.2Gy组)，R1-04(单次照射0.4Gy组)，R1-05(单次照射0.5Gy组)，R10-02(多次照射0.2Gy组，10次)，R20-04(多次照射0.4Gy组，20次)以及R25-05(多次照射0.5Gy组，25次)，当细胞模型建立成功，所有细胞标记为p0代，为了观察远期的表型改变，细胞共传至50代，并在10代、30代、50代三个节点观察不同组细胞恶性转化及EMT的程度。通过CCK-8法检测细胞的增殖能力，细胞划痕实验检测细胞的迁移水平，侵袭实验检测细胞的侵袭能力，流式细胞仪检测肺癌干细胞两个关键标志物CD133和CD44的表达，蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法(qPCR)检测EMT相关标志物的表达水平。随后我们将细胞分别照射0.2Gy、0.4Gy、0.5Gy的质子(中国原子能院，北京串列加速器核物理国家实验室)、碳离子和铁离子(日本放射线医学综合研究所，HIMAC)来比较不同空间辐射粒子对人肺上皮细胞EMT的诱导作用。根据之前的实验结果选取Ctrl、R1-05、R25-05三组细胞，p50代，进行免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)的皮下移植瘤实验并进行成瘤率分析。最后我们通过转录组学测序找到不同照射方式之间差异表达的基因，并分析了这些差异基因的功能。
(2)微重力与辐射复合处理人肺上皮细胞，细胞先进行2GyX射线的照射，随后立刻放置于双轴驱动三维回旋仪(Random position machine)上进行模拟微重力处理，设置转速(内圈和外圈)均为0-10rpm随机，模拟微重力约为0.1g，仪器放置于专门的培养箱中，48h后取下细胞进行分析，实验共分为四组:Ctrl(对照组)、IR(2Gy照射组)、RPM(模拟微重力组)和IR+RPM(复合作用组)，实验过程中Ctrl和IR组放置于同一培养箱培养。通过原子力显微镜观察细胞的三维结构，并分析细胞表面的杨氏模量、弹性情况等;蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法检测EMT相关标志物的表达情况;细胞免疫荧光法观察细胞骨架的改变，高超速离心法分离微丝蛋白和微球蛋白，并定量分析两者比例的变化。Westernblot、实时荧光定量PCR和细胞免疫荧光实验检测在辐射与微重力复合诱导的EMT过程中FN1/YAP/F-actin通路中各分子的表达情况，用小干扰RNA敲低纤维连接蛋白Fibronectin1(FN1)的表达，绘制细胞增殖曲线检测FN1敲低后的细胞增殖水平，细胞划痕实验检测FN1敲低后的细胞迁移能力，同时用免疫荧光实验检测下游分子YAP和骨架蛋白的分布和表达情况。荧光素酶报告基因实验检测FN1对YAP转录活性的调控作用。
结果:(1)7组细胞模型建立成功后，通过对第10代和第50代细胞形态的对比发现，在细胞传至第10代，对照组和单次照射细胞之间形态的差异并不明显，但多次照射后三个剂量组的细胞的胞质部分开始伸长，细胞排列不太规则，细胞之间的连接也开始不太紧密;而当传至第50代，多次照射组细胞基本失去上皮细胞生长的形态，排列杂乱，胞质伸长明显，且在R25-05组尤为显著。细胞增殖实验结果显示当细胞传至第10代，7组细胞之间无显著性差异;当细胞传至第30代，单次照射0.4Gy、0.5Gy以及多次照射0.5Gy的细胞与对照组相比增殖速度加快(p＜0.05)，但相同剂量单次与多次之间并无显著性差异;而第50代细胞所有照射组细胞与对照组相比增殖速度均有显著性差异(p＜0.05)，且相同剂量单次与多次比较，0.5Gy组多次照射要比0.5Gy单次照射的增殖速度更快(p＜0.05)。从细胞划痕结果来看，p10代各组细胞的迁移能力无显著变化;p30代各照射组细胞的增殖能力均显著增加，且在0.5Gy组，多次照射细胞的迁移能力要强于单次照射组(p＜0.05);p50代细胞中6个照射组细胞迁移能力都高于对照组(p＜0.05)，且在0.2Gy和0.4Gy组多次照射的细胞的迁移能力均强于单次照射组(p＜0.05)。细胞侵袭结果显示，当细胞传至第50代，R1-02细胞的侵袭能力无变化，其余五组细胞相对于对照组细胞的侵袭能力都有显著增强，且0.2Gy与0.4Gy的多次照射组的侵袭能力要高于单次照射组(p＜0.05)。我们用流式细胞仪检测了各组细胞中肺癌干细胞(CD133+/CD44-)的比例，结果显示，当细胞传至第10代和第50代，0.5Gy单次照射以及三组多次照射细胞的干细胞比例均有显著增加，且同剂量不同照射方式相比也有显著差异(p＜0.05)。通过Westernblot和qPCR法检测EMT标志物的表达我们发现，在蛋白水平，p10代细胞各标志物在照射后均无显著变化，p30代细胞和p50代细胞的上皮细胞标志物EpCAM表达随着剂量增加而降低;而间充质细胞的标志物Fibronectin1和Vimentin的表达随剂量的增加上调，且多次照射组较单次更为显著(p＜0.05)。通过不同代数之间的纵向比较发现，EMT在第30代细胞中开始发生。qPCR结果显示，上皮细胞标志物E钙黏蛋白和EpCAM在p30细胞中随剂量增加表达略有下降，而在p50细胞中随着照射剂量增加表达显著下调(p＜0.05)，而间充质细胞标志物Vimentin和fibronectin1的表达从p30开始就逐渐上调，多次照射组上调更显著。用质子束、碳离子束和铁离子束照射细胞后结果显示三种粒子诱发EMT的能力各有不同，碳离子和铁离子照射后E钙黏蛋白有一定程度的上调，而质子束会使其下调(p＜0.05)，而间充质细胞标志物Vimentin和fibronectin1对质子照射并不敏感，而重离子照射后这两个标志物显著上升(p＜0.05)。裸鼠成瘤实验结果显示，p50细胞中R25-05比R1-05组细胞的成瘤能力更强，成瘤率高且肿瘤的质量更大，而病理学结果显示该组细胞形成的肿瘤为肺腺癌，而对照组并无致瘤能力。转录组测序结果显示R25-05组与Ctrl相比有2410个基因的表达发生改变，其中上调的有1457个，下调的有953个，而R25-05与R1-05比较，有458个基因发生变化，上调的有221个，下调的有231个。基因GO富集分析发现，这458个差异基因多与细胞质膜、细胞外基质、NADP酶活性等相关。而KEGG分析发现，这些差异表达的基因在信号转导，癌症发生，免疫疾病等方面占比较高。
(2)原子力显微镜结果显示单纯照射组细胞的表面形态并无明显变化，微重力组和联合作用组细胞表面失去平滑性，变得粗糙，细胞伪足数量和长度均有增加，提示细胞骨架发生变化。杨氏模量分析结果显示在微重力处理后细胞的机械弹性降低，而单纯照射组的杨氏模量无显著变化，复合作用组的杨氏模量相对于单纯微重力组更低。Westernblot和qPCR结果显示在微重力和辐射处理之后细胞有发生EMT转化的趋势，且从纤维连接蛋白(FN1)这个关键分子来看，辐射与微重力诱导的EMT具有协同效应(p＜0.05)。通过免疫荧光法检测细胞骨架F-actin发现微重力组和复合效应组的细胞骨架发生解聚和坍塌，超高速离心法将细胞G-actin和F-actin分离，发现其比例在微重力组有显著降低，细胞骨架发生变化。辐射与微重力处理后纤维连接蛋白FN1的表达显著上调，并且两因素存在协同效应，通过对FN1转录因子进行分析，发现辐射与微重力并不能引起两个转录因子E2F1和β-arrestin1的mRNA水平上调，而对其进行免疫荧光实验分析发现辐射和微重力处理后β-arrestin1发生明显的入核，与此同时，细胞骨架也发生了解聚和弥散。Westernblot结果显示YAP也是对辐射与微重力敏感的分子，且两因素对YAP蛋白表达的上调有协同作用(p＜0.05)。对YAP下游三个靶基因的检测发现CRY61和PTX3的表达在微重力处理后有显著上调(p＜0.05)，而CTGF并没有显著变化。FN1敲低后，细胞增殖能力降低，迁移能力也有显著下降，下游的YAP蛋白表达降低而细胞骨架发生解聚。荧光素酶实验结果显示FN1对YAP的转录活性有调控作用，但具体机制还有待进一步探究。
结论:(1)低剂量α粒子辐射能诱导人肺上皮细胞发生恶性转化，且恶性程度与剂量存在剂量效应关系、多次照射比单次照射更易诱导细胞发生恶性转化。(2)在α粒子诱导细胞发生恶性转化之前细胞发生了EMT，EMT可能是辐射诱导细胞发生恶性转化的前期过程。(3)低剂量α粒子照射人肺上皮细胞后在长期传代培养过程中，肿瘤干细胞的比例上升，这可能是诱发恶性转化的另一个重要原因。(4)辐射与微重力可以通过细胞骨架的解聚增加细胞发生EMT的潜能，且二者具有协同作用。(5)FN1/YAP/F-actin通路在辐射与微重力复合诱导细胞EMT中发挥关键作用。
方法:(1)采用永生化人肺上皮细胞(BEAS-2B)为研究对象，选取银河宇宙射线中丰度占比为14％的α粒子作为处理因素，α源为苏州大学放射医学与防护学院的镅-241放射源。为了模拟空间环境的长期低剂量暴露，设置三个多次照射组，剂量率为0.02Gy/次，总剂量同样为0.2Gy、0.4Gy、0.5Gy，对应照射次数为10次、20次、25次，均为每三天照射一次，同时传代一次;同时，设置0.2Gy、0.4Gy、0.5Gy三个单次照射剂量组，以及一个无辐射对照组进行对比实验;在多次照射模型构建的过程中单次照射组与对照组细胞同步传代培养，直至多次照射模型建立成功，7组细胞分别标记为Ctrl(对照组)，R1-02(单次照射0.2Gy组)，R1-04(单次照射0.4Gy组)，R1-05(单次照射0.5Gy组)，R10-02(多次照射0.2Gy组，10次)，R20-04(多次照射0.4Gy组，20次)以及R25-05(多次照射0.5Gy组，25次)，当细胞模型建立成功，所有细胞标记为p0代，为了观察远期的表型改变，细胞共传至50代，并在10代、30代、50代三个节点观察不同组细胞恶性转化及EMT的程度。通过CCK-8法检测细胞的增殖能力，细胞划痕实验检测细胞的迁移水平，侵袭实验检测细胞的侵袭能力，流式细胞仪检测肺癌干细胞两个关键标志物CD133和CD44的表达，蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法(qPCR)检测EMT相关标志物的表达水平。随后我们将细胞分别照射0.2Gy、0.4Gy、0.5Gy的质子(中国原子能院，北京串列加速器核物理国家实验室)、碳离子和铁离子(日本放射线医学综合研究所，HIMAC)来比较不同空间辐射粒子对人肺上皮细胞EMT的诱导作用。根据之前的实验结果选取Ctrl、R1-05、R25-05三组细胞，p50代，进行免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)的皮下移植瘤实验并进行成瘤率分析。最后我们通过转录组学测序找到不同照射方式之间差异表达的基因，并分析了这些差异基因的功能。
(2)微重力与辐射复合处理人肺上皮细胞，细胞先进行2GyX射线的照射，随后立刻放置于双轴驱动三维回旋仪(Random position machine)上进行模拟微重力处理，设置转速(内圈和外圈)均为0-10rpm随机，模拟微重力约为0.1g，仪器放置于专门的培养箱中，48h后取下细胞进行分析，实验共分为四组:Ctrl(对照组)、IR(2Gy照射组)、RPM(模拟微重力组)和IR+RPM(复合作用组)，实验过程中Ctrl和IR组放置于同一培养箱培养。通过原子力显微镜观察细胞的三维结构，并分析细胞表面的杨氏模量、弹性情况等;蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法检测EMT相关标志物的表达情况;细胞免疫荧光法观察细胞骨架的改变，高超速离心法分离微丝蛋白和微球蛋白，并定量分析两者比例的变化。Westernblot、实时荧光定量PCR和细胞免疫荧光实验检测在辐射与微重力复合诱导的EMT过程中FN1/YAP/F-actin通路中各分子的表达情况，用小干扰RNA敲低纤维连接蛋白Fibronectin1(FN1)的表达，绘制细胞增殖曲线检测FN1敲低后的细胞增殖水平，细胞划痕实验检测FN1敲低后的细胞迁移能力，同时用免疫荧光实验检测下游分子YAP和骨架蛋白的分布和表达情况。荧光素酶报告基因实验检测FN1对YAP转录活性的调控作用。
结果:(1)7组细胞模型建立成功后，通过对第10代和第50代细胞形态的对比发现，在细胞传至第10代，对照组和单次照射细胞之间形态的差异并不明显，但多次照射后三个剂量组的细胞的胞质部分开始伸长，细胞排列不太规则，细胞之间的连接也开始不太紧密;而当传至第50代，多次照射组细胞基本失去上皮细胞生长的形态，排列杂乱，胞质伸长明显，且在R25-05组尤为显著。细胞增殖实验结果显示当细胞传至第10代，7组细胞之间无显著性差异;当细胞传至第30代，单次照射0.4Gy、0.5Gy以及多次照射0.5Gy的细胞与对照组相比增殖速度加快(p＜0.05)，但相同剂量单次与多次之间并无显著性差异;而第50代细胞所有照射组细胞与对照组相比增殖速度均有显著性差异(p＜0.05)，且相同剂量单次与多次比较，0.5Gy组多次照射要比0.5Gy单次照射的增殖速度更快(p＜0.05)。从细胞划痕结果来看，p10代各组细胞的迁移能力无显著变化;p30代各照射组细胞的增殖能力均显著增加，且在0.5Gy组，多次照射细胞的迁移能力要强于单次照射组(p＜0.05);p50代细胞中6个照射组细胞迁移能力都高于对照组(p＜0.05)，且在0.2Gy和0.4Gy组多次照射的细胞的迁移能力均强于单次照射组(p＜0.05)。细胞侵袭结果显示，当细胞传至第50代，R1-02细胞的侵袭能力无变化，其余五组细胞相对于对照组细胞的侵袭能力都有显著增强，且0.2Gy与0.4Gy的多次照射组的侵袭能力要高于单次照射组(p＜0.05)。我们用流式细胞仪检测了各组细胞中肺癌干细胞(CD133+/CD44-)的比例，结果显示，当细胞传至第10代和第50代，0.5Gy单次照射以及三组多次照射细胞的干细胞比例均有显著增加，且同剂量不同照射方式相比也有显著差异(p＜0.05)。通过Westernblot和qPCR法检测EMT标志物的表达我们发现，在蛋白水平，p10代细胞各标志物在照射后均无显著变化，p30代细胞和p50代细胞的上皮细胞标志物EpCAM表达随着剂量增加而降低;而间充质细胞的标志物Fibronectin1和Vimentin的表达随剂量的增加上调，且多次照射组较单次更为显著(p＜0.05)。通过不同代数之间的纵向比较发现，EMT在第30代细胞中开始发生。qPCR结果显示，上皮细胞标志物E钙黏蛋白和EpCAM在p30细胞中随剂量增加表达略有下降，而在p50细胞中随着照射剂量增加表达显著下调(p＜0.05)，而间充质细胞标志物Vimentin和fibronectin1的表达从p30开始就逐渐上调，多次照射组上调更显著。用质子束、碳离子束和铁离子束照射细胞后结果显示三种粒子诱发EMT的能力各有不同，碳离子和铁离子照射后E钙黏蛋白有一定程度的上调，而质子束会使其下调(p＜0.05)，而间充质细胞标志物Vimentin和fibronectin1对质子照射并不敏感，而重离子照射后这两个标志物显著上升(p＜0.05)。裸鼠成瘤实验结果显示，p50细胞中R25-05比R1-05组细胞的成瘤能力更强，成瘤率高且肿瘤的质量更大，而病理学结果显示该组细胞形成的肿瘤为肺腺癌，而对照组并无致瘤能力。转录组测序结果显示R25-05组与Ctrl相比有2410个基因的表达发生改变，其中上调的有1457个，下调的有953个，而R25-05与R1-05比较，有458个基因发生变化，上调的有221个，下调的有231个。基因GO富集分析发现，这458个差异基因多与细胞质膜、细胞外基质、NADP酶活性等相关。而KEGG分析发现，这些差异表达的基因在信号转导，癌症发生，免疫疾病等方面占比较高。
(2)原子力显微镜结果显示单纯照射组细胞的表面形态并无明显变化，微重力组和联合作用组细胞表面失去平滑性，变得粗糙，细胞伪足数量和长度均有增加，提示细胞骨架发生变化。杨氏模量分析结果显示在微重力处理后细胞的机械弹性降低，而单纯照射组的杨氏模量无显著变化，复合作用组的杨氏模量相对于单纯微重力组更低。Westernblot和qPCR结果显示在微重力和辐射处理之后细胞有发生EMT转化的趋势，且从纤维连接蛋白(FN1)这个关键分子来看，辐射与微重力诱导的EMT具有协同效应(p＜0.05)。通过免疫荧光法检测细胞骨架F-actin发现微重力组和复合效应组的细胞骨架发生解聚和坍塌，超高速离心法将细胞G-actin和F-actin分离，发现其比例在微重力组有显著降低，细胞骨架发生变化。辐射与微重力处理后纤维连接蛋白FN1的表达显著上调，并且两因素存在协同效应，通过对FN1转录因子进行分析，发现辐射与微重力并不能引起两个转录因子E2F1和β-arrestin1的mRNA水平上调，而对其进行免疫荧光实验分析发现辐射和微重力处理后β-arrestin1发生明显的入核，与此同时，细胞骨架也发生了解聚和弥散。Westernblot结果显示YAP也是对辐射与微重力敏感的分子，且两因素对YAP蛋白表达的上调有协同作用(p＜0.05)。对YAP下游三个靶基因的检测发现CRY61和PTX3的表达在微重力处理后有显著上调(p＜0.05)，而CTGF并没有显著变化。FN1敲低后，细胞增殖能力降低，迁移能力也有显著下降，下游的YAP蛋白表达降低而细胞骨架发生解聚。荧光素酶实验结果显示FN1对YAP的转录活性有调控作用，但具体机制还有待进一步探究。
结论:(1)低剂量α粒子辐射能诱导人肺上皮细胞发生恶性转化，且恶性程度与剂量存在剂量效应关系、多次照射比单次照射更易诱导细胞发生恶性转化。(2)在α粒子诱导细胞发生恶性转化之前细胞发生了EMT，EMT可能是辐射诱导细胞发生恶性转化的前期过程。(3)低剂量α粒子照射人肺上皮细胞后在长期传代培养过程中，肿瘤干细胞的比例上升，这可能是诱发恶性转化的另一个重要原因。(4)辐射与微重力可以通过细胞骨架的解聚增加细胞发生EMT的潜能，且二者具有协同作用。(5)FN1/YAP/F-actin通路在辐射与微重力复合诱导细胞EMT中发挥关键作用。