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三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是工业上广泛应用的一种有机溶剂,主要用作金属表面脱脂剂、黏合剂、润滑剂、冷冻剂等。TCE主要通过呼吸道吸入和皮肤吸收进入人体产生职业性危害,吸收后主要蓄积于肝脏、脑、心脏等器官。体内外和动物实验证明TCE及其代谢产物可引起癌变、突变、畸变、诱变及免疫毒性作用等。国际癌症研究署(IARC)在1995年对TCE致癌性分类做了修改,将其对人类非致癌改为“对人类可能致癌”。近年来,国内外因职业接触TCE而引起中毒的报道很多,为我国带来了重大经济损失。而针对TCE中毒又无特效解毒剂,使得针对性开展对TCE中毒机理的研究已经成为迫切任务。
课题组在前期的研究中在国内外首次利用蛋白质组学技术开展三氯乙烯职业中毒相关特异蛋白的研究,以期从蛋白质整体水平上认识TCE中毒发病机理。以人正常肝细胞L-02为受试细胞,建立了TCE致L-02肝细胞的剂量反应关系,筛选出一批相关差异蛋白,这些蛋白的功能大多涉及凋亡及与与肿瘤相关。
本论文在前期初步筛选出的差异蛋白基础上,进一步采用Western Blot及荧光定量PCR技术检测不同剂量TCE处理L-02肝细胞后蛋白的表达,验证初筛结果的可靠性；采用RNAi技术抑制SET的表达,探讨SET在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用；构建了SET与增强型绿色荧光蛋白EGFP的融合表达载体,为研究SET的胞内定位及过表达研究奠定基础。主要结论如下：
1.Western Blot验证结果显示,Rho GDP-dissociation inhibitor α、Annexin A3、GlyoxalaseI及SET的表达变化与二维电泳的趋势一致。说明课题组前期建立的二维电泳联合质谱鉴定技术筛选出的差异蛋白结果可靠,为进行下一步差异蛋白功能研究的奠定基础。Real-time QPCR验证了蛋白的差异表达是否发生在转录水平。L-02肝细胞在受到高剂量TCE(40 μmol/L)刺激后,ANX A3和GLO I的mRNA表达水平升高；
在受到3 μmol/L和10 μmol/L TCE刺激后,SET的mRNA表达水平也升高。三种蛋白的mRNA表达趋势与蛋白表达一致,说明这些蛋白的差异表达发生在转录水平,为后续进行基因干预研究提供了基础。而Rho GDI α在mRNA水平却与蛋白表达不一致,用40 μmol/L TCE处理肝细胞后,与对照组相比,mRNA表达下降,而蛋白水平却是升高,这可能与蛋白翻译修饰有关,具体的机理还需进一步研究。
2.针对SET基因设计2条特异性的shRYA。酶切及测序鉴定结果表明,靶向SET的shRNA真核表达载体构建成功。以脂质体LipofectamineTM 2000为介导,将构建成功的shRNA真核表达载体转染L-02肝细胞进行瞬时表达,Western Blot检测SET瞬时干扰效果,结果显示转染48 h,psiRNA1干扰效果最好,达到40％以上。
3.瞬时转染48 h后再用不同剂量(3μmol/L、10μmol/L)的TCE处理24 h。流式细胞术检测结果表明,与psiRNAc+3μmol/LTCE组相比,psiRNAc+10μmol/LTCE组G1期细胞比例增加,而S期细胞比例明显降低；而与psiRNA1+3μmol/LTCE组相比,psiRNA1+10μmol/LTCE组G1期细胞比例降低,而S期细胞比例明显增加。与psiRNAc+3μmol/LTCE组相比,psiRNAc+10μmol/LTCE组早期凋亡细胞没有变化,死亡细胞增多；而与psiRNA1+3μmol/LTCE组相比,psiRNA1+10μmol/LTCE组早期凋亡细胞从14.0％增加到了23.2％,晚期凋亡细胞从9.7％增加到17.2％。是否与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶CDKs的磷酸化水平变化及细胞内MAPK/ERK途径的抑制有关还需进一步研究。
4.成功构建了SET融合表达载体pEGFP-N2-SET并在肝细胞中进行了表达,为今后研究SET在肝细胞中的亚细胞定位及过表达研究奠定基础。