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失神经喉肌等骨骼肌的再生和功能重建是临床关注的热点，而神经肌肉接头重建和成肌干细胞分化融合修复受损肌纤维是失神经骨骼肌再生和功能恢复的关键。因此，为了更好的研究失神经喉肌等骨骼肌的再生机制，从而为干预神经肌肉再生关键分子事件提供新的治疗策略和理论依据，建立一个适当的体外模型显得至关重要。而脊髓前角运动神经元-骨骼肌细胞共培养就是其中的关键技术之一。目前，大部分已知的神经肌肉体外共培养模型均采用含血清培养基，这为体外神经肌肉接头的形成提供了一个功能性的模型系统，但血清的使用也增加了不必要的变异性，由于使用血清使重复体外神经肌肉共培养体系时描述和量化所需的最低因素变得不可能，因此，也有人设计了新型的无血清培养技术用于神经肌肉共培养，以促进功能性的神经肌肉接头的形成。运动神经元及骨骼肌细胞的取材也不尽相同，而其中培养体外分离的胚胎神经元和骨骼肌细胞便利了对脊椎动物神经肌肉接头发展过程的分析，复制组织型的细胞与细胞之间的相互作用往往很难达到分离胚胎干细胞所能达到的效果。从脊髓外植体获得的胚胎运动神经元或者轴突与骨骼肌细胞的培养，容易形成功能性的突触，可以达到很高程度的结构和功能的分化。目前，对体外神经肌肉突触形成中分离细胞培养的研究已经取得了一些关键性的成果。在过去的研究中，Chen等采用NG108-15/C2C12共培养模型用来测定肌管上形成的作为神经肌肉接头形成最早的标记物乙酰胆碱受体（AchR）簇集。虽然NG108-15细胞可以长出轴突并延伸到附近的肌管，但由于NG108-15细胞为小鼠神经母细胞瘤细胞与大鼠胶质瘤细胞之融合细胞，其特性和功能状态都远不能完全代替神经元原代细胞，故在共培养3天后，NG108-15细胞逐渐凋亡，AchR的聚集也明显降低。亦有研究证明，大鼠神经元-肌肉共培养可以形成大量的早期NMJ，并可以检测到神经元轴突诱导的突触后膜AchR的聚集，但由于原代骨骼肌卫星肌细胞取材难度较大，纯化过程较为繁杂，培养条件较高且传至9代后细胞即出现衰老特征，不能无限代地进行传代培养。因此，本实验拟在此基础上进行适当地改进，首次采用SD大鼠胎鼠脊髓前角运动神经元原代细胞和C2C12细胞进行共培养，在体外建立一个稳定的神经肌肉接头(NMJ)模型，该共培养操作过程更为简单，重复性好，细胞状态佳，存活时间更久，且更易于分析，从而为进一步研究体内外神经肌肉接头功能状态及再生奠定基础。第一部分胚胎大鼠脊髓前角运动神经元原代分离和培养研究目的：能够熟练的进行原代神经细胞的提取与培养，并进行提纯和鉴定，以获取体外形成神经肌肉接头所需的胚胎大鼠脊髓前角运动神经元。材料和方法：取孕15d~16d SD大鼠，取出胚胎大鼠腹侧半脊髓组织，经胰酶消化和机械破碎的方法处理分散成单个细胞，经差速贴壁法纯化运动神经元，置于无血清限定性培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，倒置显微下观察神经元形态、结构的变化，并采用免疫荧光法检测脊髓运动神经元特异性标记物胆碱乙酰基转移酶多克隆抗体（ChAT）以鉴定运动神经元。结果：孕15d~16d胎鼠易于取材且所得运动神经元细胞数量多、状态好、细胞活力旺盛，联合Neurobasal+2%B27培养基培养的脊髓前角运动神经元细胞纯度高，约为85%，能够在体外培养条件下存活7~10d左右, ChAT反应结果呈现阳性。结论：通过采用胎龄15d~16d胎鼠脊髓腹侧半联合无血清特定性培养基培养细胞的方法成功分离培养并获得纯度较高的脊髓前角运动神经元，ChAT能够特异性标记脊髓运动神经元，且培养前5~7天，MNs数量稳定，未见明显减少，为课题实施提供可靠的运动神经元来源，同时也为后续共培养体系的建立在时间上创造了条件。第二部分成肌细胞C2C12体外成肌分化模型的建立研究目的：完善肌母细胞C2C12体外培养方法，观察细胞增殖、分化、融合成肌的生物学特性。材料与方法：体外培养成肌细胞C2C12，在含10%胎牛血清的增殖培养液(GM)中扩增培养，待细胞生长至密度为60%~70%时，换为含2%马血清的分化培养液(DM)诱导分化。倒置显微镜下观察各个阶段骨骼肌细胞的形态特征变化并拍照。采用免疫荧光法抗肌球蛋白重链抗体MHC特异性标记肌管。结果：体外培养时，C2C12细胞汇合至60%~70%时，换DM诱导分化，即开始逐步相互融合形成肌管细胞并表达MHC蛋白，约5d左右形成成熟的肌管，MHC特异性反应呈阳性。结论：成肌细胞C2C12体外培养时能够稳定传代，无需特殊诱导方法，用含2%马血清的分化培养液(DM)即可诱导分化形成成熟的肌管细胞，为共培养体系的建立提供稳定的骨骼肌肌管来源。第三部分运动神经元-骨骼肌细胞共培养体系的建立研究目的：获得运动神经元-骨骼肌细胞共培养条件，建立运动神经元-骨骼肌细胞共培养体系，在体外形成神经肌肉接头。材料与方法： C2C12成肌细胞株体外扩增培养至60%~70%汇合时，分化培养基（DM）诱导分化，培养约3d，开始分化融合形成肌管。取孕15d~16dSD大鼠，提取胚胎大鼠脊髓前角运动神经元细胞，种植到分化5d的肌管细胞中，含2%马血清的分化培养液(DM)共培养。倒置显微镜下观察各个阶段神经元形态及突起长度的变化、肌管形态特征变化及收缩特性、神经肌肉接头的形成。通过活体细胞孵育alpha--BTX)观察突触后膜AchR的位置及分布，并采用屏幕录像技术记录共培养中肌肉收缩现象，这从另一个方面证明共培养后NMJ的形成。结果：更换为共培养培养基后，SKMs和MNs均能存活并进一步地分化成熟。在共培养细胞中，MNs在形态学上易于鉴别，共培养约4h后，倒置显微镜下可观察到部分脊髓运动神经元开始贴壁，呈单个圆形或椭圆形，12h后，大部分细胞均已贴壁，24h后, MNs胞体逐渐形成突起，肌管细胞进一步融合增粗并相互形成网络状，第3d~5d,神经元生长旺盛、胞体饱满、光晕明显、突起增多并延长，部分MNs开始与肌管细胞形成连接；约1周左右可见MNs伸出的轴突延伸至肌管膜表面或包绕肌管，肌管按同一方向排列，出现广泛地节律性收缩；共培养约10d后，运动神经元开始凋亡，肌管细胞逐渐出现萎缩现象。结论：在体外培养条件下，无需特殊培养基和各种营养因子，运动神经元和骨骼肌细胞即可共同生存、生长并进一步发育，建立突触连接，触发一系列神经肌肉接头信号转导，引发肌管节律性收缩。