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本研究对家蚕雌蛾交配囊精液进行了活化及人工授精试验,并采用不同的冷冻方法对家蚕交配囊精液进行低温冷冻保存。对解冻后的精子进行了DNA损伤测定及人工授精试验。对家蚕精子中的超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶及顶体酶的活性测定方法进行了研究,探讨了冷冻前后酶活性的变化及其与人工授精产受精卵率之间的关系。 1 家蚕雌蛾交配囊精液的活化与人工授精 采用姬姆萨染色及显微镜下直接观察家蚕雌蛾交配囊中精液,并用交配囊精液进行人工授精,研究发现:交配20～30 min雌蛾交配囊中精液与雄蛾储精囊中精液一样,精液未被活化,含有大量有核精子束。用不同浓度的胰蛋白酶处理精液后在显微镜下观察与人工授精的结果显示,0.2μg/mL的胰蛋白酶处理精液受精卵得率最高。用胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶及琥珀酸钠处理精液,仅胰蛋白酶能够在很好的溶解有核精子束的同时提高无核精子的运动性,也只有胰蛋白酶处理的精液人工授精能够得到受精卵。研究还发现经2倍稀释的精液人工授精效果最佳。 2 家蚕雌蛾交配囊精液的冷冻、解冻及冷冻精子的DNA损伤测定与人工授精 将交配囊精液分别保存在-80℃和液氮中,经过一定时间后将其解冻。并采用单细胞凝胶电泳法对冷冻精子进行了DNA损伤检测,结果发现未加冷冻保护剂的精液经过低温冷冻后部分精子电泳图呈明显的彗星状,其DNA损伤程度与对照组相比差异显著,表明DNA受到了一定程度的损伤;而添加冷冻保护剂的精液无论在-80℃是在液氮中保存,冷冻后其精子的电泳图仍然呈圆形,DNA损伤程度与对照组无显著性差异。 未活化的精液在-80℃和液氮中冷冻后都能产受精卵,但在-80℃保存了3个月后就失去了能育性,而液氮中保存的精液在经历了1年后其受精卵率仍保持在82.2%。研究还发现中系家蚕品种精液的能育性要高于日本系统种、杂交种要高于原种。采用三倍体精子对人工授精后的雌蛾进行再交,结果提高了雌蛾产卵数及受精卵率。 3 家蚕冷冻精液超氧化物歧化酶(SOD)活性分析 超氧化物歧化酶是生物体抗氧化防御体系的重要酶类,不同冷冻方法和冷冻时间对精液SOD活性的影响不同。通过酶活性的测定可以看出提取的精液在5h内酶活性变化不明显;-80℃冷存的精液精子SOD活性随时间呈线性下降,3个月后酶活性仅为冷存前的23%左右;经液氮冷存的精液精子SOD活性下降55%,保存1天与保存3个月的精液精子SOD活性变化不大;精清中的酶活性上升与精子中的酶活性下降趋势相关。